王晶晶，王 婷，張新笑，卞 歡，耿志明，李鵬鵬,*，王道營，徐為民,3

（1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)肉品加工與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095；3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210095）

脂肪氧合酶（lipoxygenase，LOX）屬于氧化還原酶[1]，是一種含非血紅素鐵的雙加氧酶。LOX專一性作用于多不飽和脂肪酸的順,順-1,4-戊二烯基位置，通過分子內(nèi)加氧，生成具有共軛雙鍵的氫過氧化物[2]。LOX在生物體內(nèi)的主要作用底物是亞麻酸、亞油酸和花生四烯酸，依據(jù)其加氧位置的特異性，將LOX分為5-LOX、8-LOX、9-LOX、10-LOX、11-LOX、12-LOX、13-LOX、15-LOX，其中15-LOX廣泛存在于動(dòng)植物、細(xì)菌和真菌中[3-5]。15-LOX對(duì)脂肪酸的作用底物除了亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸，還可以是磷脂、膽固醇脂，甘油三脂等含有不飽和脂肪酸以及更復(fù)雜的脂質(zhì)蛋白質(zhì)分子。豬的白血球型12-LOX與人的網(wǎng)織紅細(xì)胞15-LOX相近，既能催化C-12氧化，也可催化C-15氧化，15-LOX的最適底物為亞油酸并且催化C-13氧化[6-7]。

Andre等[8]于1932年首次發(fā)現(xiàn)酶促氧化反應(yīng)是大豆制品的豆腥味的主要來源，其中的關(guān)鍵酶即LOX。Fu Xiangjin等[9-10]研究證實(shí)白鰱魚在貯藏和加工過程中出現(xiàn)的腥味增強(qiáng)主要是由白鰱魚體內(nèi)的LOX催化降解不飽和脂肪酸產(chǎn)生的各種醛類物質(zhì)引起的。此后，人們對(duì)LOX在食品加工貯藏過程中對(duì)風(fēng)味的影響進(jìn)行了廣泛研究。研究表明，LOX氧化多不飽和脂肪酸生成的氫過氧化物極不穩(wěn)定，進(jìn)一步反應(yīng)生成多種揮發(fā)性化合物，這些物質(zhì)一方面形成食品的主要風(fēng)味物質(zhì)，例如新鮮水果蔬菜的風(fēng)味物質(zhì)醛類即由LOX氧化多不飽和脂肪酸途徑生成[11-12]，干腌肉制品的主要風(fēng)味物質(zhì)己醛也是脂質(zhì)氧化降解生成[13-14]；另一方面，食品中脂質(zhì)的過度氧化產(chǎn)生刺激性氣味物質(zhì)，不僅導(dǎo)致食品風(fēng)味劣變，還造成食物多不飽和脂肪酸含量下降，導(dǎo)致食物營養(yǎng)品質(zhì)的下降并增加食品儲(chǔ)藏的困難[15-20]。脂類物質(zhì)的氧化分為自動(dòng)氧化和酶促氧化[21]，LOX是酶促氧化最主要的內(nèi)源酶。Gata等[22]通過硫酸銨沉淀、DEAE陰離子交換和疏水層析等純化步驟從豬股二頭肌中分離得到一種LOX，對(duì)其性質(zhì)的研究表明LOX可能參與伊比利亞火腿的風(fēng)味形成。Jin Guofeng等[23]研究表明LOX在干腌培根加工過程中的脂肪氧化起重要作用，溫度、酸度和鹽含量是影響LOX活力的主要因素。研究LOX在肉品脂質(zhì)氧化過程中的作用及其影響因素，對(duì)調(diào)控肉品風(fēng)味品質(zhì)具有重要的理論和實(shí)踐意義。

盡管人們?cè)缫颜J(rèn)識(shí)到LOX在肉品加工中的潛在應(yīng)用價(jià)值，但從豬肉中直接獲得不僅得率低而且純化難，獲得LOX純酶的成本很高；通過LOX基因的克隆與表達(dá)，經(jīng)簡單的純化過程，獲得高純度的LOX，能有效解決上述問題[23]。至今為止，還未曾有體外重組表達(dá)豬肉LOX的報(bào)道。為更好地研究豬肉加工和貯藏過程中風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生機(jī)理和途徑，研發(fā)新型工藝，既保留風(fēng)味物質(zhì)又能保持豬肉加工過程中的品質(zhì)和營養(yǎng)價(jià)值。豬肉12-LOX的編碼基因序列已在GenBank公布（GenBank登錄號(hào)M31417.1）。豬肉12-LOX包括兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端的β桶結(jié)構(gòu)域?qū)儆贑2家族蛋白，主要負(fù)責(zé)12-LOX與膜的結(jié)合；C端的催化結(jié)構(gòu)域。本研究以豬肉為原料，從中獲取12-脂肪氧合酶催化結(jié)構(gòu)域（12-lipoxygenase catalytic domain，12-LOXcd）的編碼基因，對(duì)該酶進(jìn)行提取純化，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，與大豆LOX的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行比較，因?yàn)榇蠖怪蠰OX含量與活力較高且研究較多，為豬肉制品的加工和貯藏加工提供技術(shù)和數(shù)據(jù)支持[24]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌DH5α 南京擎科生物工程有限公司；大腸桿菌表達(dá)載體pMBP 本實(shí)驗(yàn)室保藏；TransStart?FastPfu DNA Polymerase試劑盒、大腸桿菌TranSetta2 北京全式金生物技術(shù)有限公司；酵母提取物、胰蛋白胨 美國Oxoid公司；瓊脂粉 南京奧多福尼生物科技有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；異丙基β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）、氨芐青霉素、卡那霉素 上海生工生物股份有限公司；亞油酸、大豆脂氧酶（15 MU）美國Sigma公司；pMD19-T 載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶 寶生物工程（大連）有限公司；TEV蛋白酶 本實(shí)驗(yàn)室制備；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g。加水溶解后，加水定容到1 000 mL。配制固體培養(yǎng)基時(shí)，每100 mL加入瓊脂粉1.5 g。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-6100型分光光度計(jì) 上海美普達(dá)儀器有限公司；TP600梯度升降溫功能聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 上海天呈醫(yī)流科技股份有限公司；M124A分析天平 意大利BEL公司；ZEALWAY（致微）G154DWS滅菌器 廈門儀器有限公司；Mini-PROTEANTetra Cell電泳儀 美國Bio-Rad公司；DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀電泳槽、DYCP-31DN瓊脂糖水平電泳儀電泳槽 北京六一儀器廠；AKTA蛋白純化系統(tǒng) 美國GE Healthcare公司；BioTekSynergy2多功能酶標(biāo)儀 美國BioTek公司；Scientz-IID超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技有限公司；Tanon-1600全自動(dòng)凝膠成像分析儀 上海天能儀器有限公司；VD-650超凈工作臺(tái) 蘇州江東精密儀器有限公司；ZQTY-90S臺(tái)式全溫振蕩培養(yǎng)箱 上海知楚儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成

由NCBI公布的豬肉基因組12-LOX基因預(yù)測序列，篩選到該基因的CDS序列，運(yùn)用Primer 5.0設(shè)計(jì)基因的特異性引物。上游引物（F）：5’-TTCCATATGGGCACTGCCCGCACA-3’（下劃線是NdeI酶切位點(diǎn)）；下游引物（R）：5’-CGCTCGAGGATGGCCACACTGTTT-3’（下劃線是XhoI酶切位點(diǎn)）。引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

1.3.2 總RNA提取及cDNA合成

豬肉總RNA的提取根據(jù)TaKaRa公司的TRIzol說明書進(jìn)行操作。取豬腿肉100 mg，提取總RNA，總RNA經(jīng)電泳檢測，Eppendorf公司核酸定量分析儀測定OD260nm/OD280nm比值及濃度，以1 μg總RNA為模板，按照cDNA合成試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄程序：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃保存，若要長期保存則應(yīng)放于-20 ℃。

1.3.3 目的基因的獲得

以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL，其中模板1 μL，上、下游引物各1 μL，5×TransStart?FastPfu Buffer 10 μL，TransStart?FastPfu DNA Polymerase 1 μL，5×激活劑5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，ddH2O 27 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃、20 s；60 ℃、20 s；72 ℃、90 s，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸30 s。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，連接至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，取少量菌液涂在含氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，然后挑取陽性單菌落進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)菌落PCR和酶切鑒定，將連接正確的重組基因質(zhì)粒送至南京生物工程股份有限公司測序。

1.3.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

凝膠回收的PCR產(chǎn)物以及原核表達(dá)載體pMBP分別用NdeI和XhoI在37 ℃條件下雙酶切2 h，再分別進(jìn)行切膠純化回收后，用T4連接酶連接（22 ℃，2 h），將重組質(zhì)粒全部轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。涂布于含有卡娜青霉素的LB平板，倒置，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定是否構(gòu)建成功，篩選出陽性重組質(zhì)粒并送至南京生物工程股份有限公司測序。

1.3.5 融合蛋白的原核表達(dá)及可溶性分析

經(jīng)過鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TranSetta2感受態(tài)細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后挑取單菌落接種至5 mL含100 μg/mL卡那青霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液濃度OD600nm值為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.25 mmol/L，22 ℃、200 r/min誘導(dǎo)過夜。離心收集沉淀，1∶5的比例加入緩沖液（20 mmol/L磷酸鹽，pH 7.6，120 mmol/L NaCl）重懸菌體，于超聲波細(xì)胞破碎儀上破碎10 min（80 W，φ 2，開1 s，停3 s），取出40 μL作為總菌后12 000 r/min、4 ℃離心5 min，分別取出上清液、沉淀40 μL，加入10 μL十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）上樣緩沖液，95 ℃加熱10 min，12 000 r/min離心5 min。用12% SDS-PAGE檢測融合蛋白是否為可溶性蛋白，設(shè)置不加IPTG誘導(dǎo)的菌液作為對(duì)照。

1.3.6 重組融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將上述鑒定能可溶性表達(dá)12-LOXcd的菌落接種于1 L含卡那青霉素的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)接種1 L含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基（Tev-nohis）。分別離心（4 000 r/min，20 min）收集菌體，用Binding Buffer（20 mmol/L磷酸鹽，pH 7.6，150 mmol/L NaCl，5 mmol/L咪唑，10%甘油）重懸菌體，冰浴條件下超聲破碎30 min（功率150 W，超聲1 s，間停3 s），再離心（12 000 r/min，20 min，4 ℃）收集上清液，棄菌體沉淀，將兩個(gè)菌液的上清液混勻后放4 ℃酶切24 h，切除麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose binding protein，MBP）。24 h后，上清液12 000 r/min、4 ℃離心20 min，留上清液。鎳柱平衡后將上清液加入鎳親和層析柱中，分別用不同濃度的咪唑洗脫液洗脫并收集，初步純化目的蛋白，取收集的樣液加入SDS-PAGE上樣緩沖液，加熱（95 ℃，10 min），用12% SDS-PAGE檢測重組蛋白的表達(dá)情況。將較純的樣品用10 kDa的超濾管離心濃縮（4 ℃，3 500×g，10 min/次）。最后用Superdex G200進(jìn)一步純化，然后再次用SDS-PAGE檢測純化的產(chǎn)物并離心濃縮。用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，分裝后置于-80 ℃保存。

1.3.7 豬肉12-LOXcd、大豆LOX活力測定及酶學(xué)性質(zhì)比較

1.3.7.1 底物溶液配制

0.5 mmoL亞油酸溶于5 mL含180 μL Tween 20的脫氧重蒸水中，充分混勻；滴加1 mol/L NaOH溶液充分混勻使體系成為清澈透明的液體，再用1 mol/L HCl溶液調(diào)pH值至9.0，最后用脫氧重蒸水定容至50 mL。將配制好的亞油酸儲(chǔ)備液分裝保存在EP管中，并于-20 ℃下貯存[25]。

1.3.7.2 酶活力測定

豬肉12-LOXcd活力測定在Kermasha等[26]的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。取200 μL亞油酸底物儲(chǔ)備液與2.9 mL、50 mmol/L的檸檬酸緩沖液（pH 5.5）充分混合，待其在234 nm波長處的吸光度穩(wěn)定后，加入100 μL酶液（稀釋10 倍），迅速混合，于234 nm波長處測定其1.0 min內(nèi)吸光度的增加量。以200 μL亞油酸底物儲(chǔ)備液與2.9 mL檸檬酸緩沖液混合為空白。

LOX活力定義[27]：在一定的溫度和pH值條件下，反應(yīng)體系在234 nm波長處每分鐘吸光度增加0.001表示為1 個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.7.3 最適pH值及其pH值穩(wěn)定性

按1.3.7.2節(jié)所述，在37 ℃下利用pH 4.0～10.0系列緩沖溶液分別替代反應(yīng)體系中的50 mmol/L、pH 5.5檸檬酸緩沖溶液測定酶活力，以酶活力最高值為100%，計(jì)算不同pH值下的相對(duì)活力，分析不同pH值對(duì)酶活力的影響情況。pH值為4.0、5.0、6.0緩沖液用50 mmol/L的檸檬酸和檸檬酸三鈉配制；pH 7.0、8.0緩沖液用50 mmol/L的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉配制；pH 9.0、10.0緩沖液用50 mmol/L甘氨酸和NaOH配制。

進(jìn)一步考察酶pH值穩(wěn)定性。將酶液分別置于上述不同的pH值緩沖液中，于37 ℃下孵育1 h，取出測定酶活力，以酶活力初始值為100%，計(jì)算不同pH值下的殘留活力。

1.3.7.4 最適溫度及熱穩(wěn)定性

按1.3.7.2節(jié)所述，分別在10、20、30、40、50、60、70 ℃測定豬肉12-LOXcd和大豆LOX活力，以酶活力最高值為100%，計(jì)算不同溫度下的相對(duì)活力。

進(jìn)一步考察豬肉12-LOXcd、大豆LOX在不同溫度下的穩(wěn)定性。將酶液分別置于10、20、30、40、50、60 ℃下保存30 min，取出測定酶活力，以酶活力最高值為100%，計(jì)算不同溫度下酶的殘留活力。

1.3.7.5 NaCl添加量對(duì)酶活力的影響

用最適pH值下的緩沖液分別配制0%、1%、3%、5%、7%、9%的NaCl溶液。然后在室溫條件下按1.3.7.2節(jié)方法所述進(jìn)行酶活力測定。

1.3.8 豬肉12-LOXcd的底物特異性

分別以不同濃度的亞油酸、亞麻酸、花生四烯酸為底物，采用雙倒數(shù)作圖法求得不同底物的Km，比較豬肉12-LOXcd對(duì)不同底物的親和力。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

采用凝膠成像儀對(duì)電泳圖進(jìn)行分析。每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行，酶活力圖采用Origin 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，測定結(jié)果以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬肉12-LOXcd基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建

圖 1 pMBP-12-LOXcd融 合蛋白示意圖（A）、12-LOXcd基因擴(kuò)增結(jié)果（B）及重組質(zhì)粒的酶切鑒定（C）Fig. 1 Schematic demonstration of pMBP-12-LOXcd fusion protein (A),PCR-amplified 12-LOXcd (B) and identification of recombinant plasmid pMBP-12-LOXcd by enzymatic digestion (C)

初期研究發(fā)現(xiàn)12-LOXcd蛋白在大腸桿菌中表達(dá)以包涵體形式存在，包涵體形式表達(dá)蛋白質(zhì)的氨基酸不能形成正確的空間結(jié)構(gòu)，影響蛋白的活性，如果對(duì)包涵體蛋白進(jìn)行變性復(fù)性等操作，使蛋白活性丟失，影響后續(xù)研究和應(yīng)用。經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用MBP作為分子伴侶蛋白與12-LOXcd融合表達(dá)可以有效解決蛋白以包涵體形式在大腸桿菌中表達(dá)的問題[28]，因此本研究將MBP的編碼基因malE通過基因重組技術(shù)構(gòu)建入普通表達(dá)載體中，并同時(shí)引入了TEV酶切位點(diǎn)（圖1A），便于后續(xù)切除融合蛋白N端的MBP。

以獲得的cDNA為模板，擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后可見1 656 bp處的片段（圖1B），條帶大小符合預(yù)期。預(yù)測12-LOXcd編碼553 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為62 kDa。

將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒用NdeI和XhoI雙酶切鑒定（圖1C），得到約5 400 bp的大片段和約1 700 bp的小片段，分別與pMBP和12-LOXcd基因大小相符。進(jìn)一步測序結(jié)果均準(zhǔn)確無誤，表明目的基因已成功克隆至表達(dá)載體pMBP中，重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，命名為pMBP-12-LOXcd。

2.2 豬肉12-LOXcd重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性檢測結(jié)果

如圖2所示，第1泳道即未加IPTG誘導(dǎo)劑的重組菌在預(yù)期大小的條帶處沒有明顯的表達(dá)條帶出現(xiàn)；第4泳道明顯看出該系統(tǒng)能大量可溶性表達(dá)融合pMBP-12-LOXcd蛋白，大小約100 kDa（12-LOXcd 62 kDa和MBP 40 kDa），與預(yù)期大小一致。

2.3 重組蛋白的純化

2.3.1 豬肉12-LOXcd重組蛋白的初步純化

融合pMBP-12-LOXcd蛋白在純化前進(jìn)行TEV蛋白酶切，SDS-PAGE顯示成功將MBP標(biāo)簽切除，得到C端帶有His標(biāo)簽的12-LOXcd蛋白（～62 kDa），采用Ni-NTAAgarose親和層析純化。收集不同咪唑濃度緩沖液洗脫得到的組分，進(jìn)行SDS-PAGE檢測。圖3結(jié)果顯示，通過20 mmol/L和50 mmol/L咪唑洗脫可去除較多雜蛋白，100 mmol/L和250 mmol/L的咪唑洗脫可得到較純的12-LOXcd重組蛋白，說明可以用此方法純化目的蛋白。將100 mmol/L和250 mmol/L咪唑洗脫收集得到的蛋白用截留分子質(zhì)量為10 kDa的超濾管進(jìn)行濃縮，為下一步凝膠過濾層析做準(zhǔn)備。

2.3.2 12-LOXcd重組蛋白的凝膠過濾層析

圖 4 12-LOXcd凝膠過濾層析色譜圖及SDS-PAGE圖譜Fig. 4 Gel filtration chromatography and SDS-PAGE analysis of recombinant 12-LOXcd protein

如圖4所示，濃縮后的蛋白經(jīng)過Superdex G200層析柱純化后得到3 個(gè)洗脫峰，分別收集不同的洗脫峰并用12% SDS-PAGE檢測。結(jié)果顯示，經(jīng)凝膠過濾層析后的蛋白條帶單一，雜帶消失。圖中2號(hào)洗脫峰為目的蛋白12-LOXcd，將該洗脫峰收集的蛋白用10 kDa的超濾管濃縮后，用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，分裝后放-80 ℃保存待用。

2.4 豬肉12-LOXcd、大豆LOX酶學(xué)性質(zhì)的比較

2.4.1 pH值對(duì)酶活力影響及其穩(wěn)定性

在室溫條件下，測定LOX在不同pH值條件下的活力，結(jié)果如圖5所示。在pH 4.0～6.0豬肉12-LOXcd活力逐漸增加，在pH 6.0時(shí)，酶活力達(dá)到最大，之后隨著pH值的升高而降低，當(dāng)pH值達(dá)到10.0時(shí)，大豆LOX活力基本為0；大豆LOX與豬肉12-LOXcd有相同的變化趨勢，其最適pH值為8.0。豬肉12-LOXcd在酸性條件下酶活力較高，這與陳欣[29]、Gate[22]、何立超[25]等研究結(jié)果一致。酶的活性中心結(jié)構(gòu)在不同pH值條件下會(huì)發(fā)生變化，因此隨著pH值的改變，酶與底物的結(jié)合方式和生成中間產(chǎn)物會(huì)發(fā)生變化，從而影響酶反應(yīng)速率[30]。本實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)pH值小于6.0時(shí)，隨著緩沖液pH值的升高，12-LOXcd的活性狀態(tài)可能在逐漸地向有利于催化反應(yīng)發(fā)生的方向發(fā)生改變，因此隨著pH值的逐漸升高，12-LOXcd活力呈逐漸增大趨勢。

圖 5 pH值對(duì)大豆LOX和豬肉12-LOXcd活力的影響Fig. 5 Effect of pH value on the activity of soybean LOX and pig muscle 12-LOXcd

進(jìn)一步考察酶pH值穩(wěn)定性，測定兩種酶在不同pH值（4.0～10.0）緩沖液體系下孵育1 h后的剩余酶活力。由圖6可知，豬肉12-LOXcd在中性和酸性條件下穩(wěn)定性較差，隨著pH值的升高，豬肉12-LOXcd的穩(wěn)定性明顯提高，而大豆LOX在堿性環(huán)境下穩(wěn)定性較差。在pH 10條件下處理1 h，豬肉12-LOXcd的殘留活力高達(dá)初始酶活力的80%，而此時(shí)大豆LOX的殘留活力僅為初始酶活力的40%。

圖 6 大豆LOX和豬肉12-LOXcd的pH值穩(wěn)定性Fig. 6 pH stability of soybean LOX and pig muscle 12-LOXcd

2.4.2 溫度對(duì)酶活力及穩(wěn)定性的影響

由圖7可以看出，豬肉12-LOXcd和大豆LOX活力均呈先上升后下降的趨勢，其最適反應(yīng)溫度分別為30 ℃和20 ℃。何立超等[31]研究發(fā)現(xiàn)櫻桃谷鴨胸肉LOX純酶的最適溫度為30 ℃，與本研究具有一致性；而王邦國等[32]研究發(fā)現(xiàn)白鰱魚肌肉LOX最適作用溫度為40 ℃，這與本研究結(jié)果存在一定差異，可能與不同種類的動(dòng)物有關(guān)。溫度升高能夠增加反應(yīng)的活化分子數(shù)，從而加快反應(yīng)速率，促進(jìn)酶促反應(yīng)。但溫度過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變形，又會(huì)使酶活力下降。在本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)溫度上升到約45 ℃時(shí)，豬肉12-LOXcd活力下降至最適溫度條件下的50%以下，說明豬肉12-LOXcd蛋白質(zhì)在此溫度條件下可能已經(jīng)發(fā)生變性，而在溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，酶活力基本為零。

圖 7 溫度對(duì)豬肉12-LOXcd和大豆LOX活力的影響Fig. 7 Effect of temperature on the activity of soybean LOX and pig muscle 12-LOXcd

進(jìn)一步觀察兩種LOX的熱穩(wěn)定性，分別在10～70 ℃條件下孵育酶液30 min，取出并立即在冰水浴中冷卻后，測定殘余脂氧合酶活力，由圖8可知，隨著溫度的升高，豬肉12-LOXcd與大豆LOX殘留活力均不斷下降，但豬肉12-LOXcd殘留活力的變化比較平緩，在40 ℃時(shí)仍保留70%以上活力；而大豆LOX的殘留酶活力急劇下降。陳欣等[29]的研究結(jié)果顯示，大豆LOX與麻鴨LOX的殘留活力均隨溫度的升高而降低，當(dāng)溫度低于50 ℃時(shí)，兩者的變化不明顯，但當(dāng)溫度高于50 ℃時(shí)，大豆LOX殘留酶活急劇下降，而麻鴨LOX殘留酶活力的變化則較為平緩。因此LOX在肉制品的加工應(yīng)用中能夠保持一定的活力。

圖 8 豬肉12-LOXcd和大豆LOX的熱穩(wěn)定性Fig. 8 Thermal stability of soybean LOX and pig muscle 12-LOXcd

2.4.3 NaCl添加量對(duì)酶活力的影響

圖 9 NaCl添加量對(duì)豬肉12-LOXcd、大豆LOX活力的影響Fig. 9 Effect of NaCl concentration on the activity of soybean LOX and pig muscle 12-LOXcd

由圖9可以看出，豬肉12-LOXcd活力在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)達(dá)到最高。繼續(xù)增加鹽分含量，酶活力略微下降，但仍能夠保持較高的活力。這與Jin Guofeng等[23]的研究結(jié)果具有一定的一致性，即在一定范圍內(nèi)增加培根中鹽分含量能夠促進(jìn)肌肉中脂肪的氧化，但當(dāng)鹽分含量達(dá)到一定值后，若繼續(xù)增大鹽分含量又會(huì)抑制脂質(zhì)氧化?？傮w而言，豬肉12-LOXcd在較高NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)下較穩(wěn)定，而大豆LOX活力則隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而持續(xù)降低。

2.5 豬肉12-LOXcd的底物特異性

以亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸作為反應(yīng)的底物，根據(jù)雙倒數(shù)作圖法求得各個(gè)底物的Km,檢測豬肉12-LOXcd對(duì)不同底物的親和性。求得亞油酸的Km為0.40 mmol/L，亞麻酸Km為0.55 mmol/L，花生四烯酸Km為4.15 mmol/L。Km越小，底物親和力越大，因此豬肉12-LOXcd對(duì)亞油酸的親和性最高，這與Gata等[22]研究結(jié)果具有一致性。

3 結(jié) 論

LOX對(duì)肉品加工貯藏過程中的風(fēng)味品質(zhì)起重要調(diào)節(jié)作用，目前國內(nèi)外研究相對(duì)較少，僅有Jin Guofeng等[23]、郇延軍[13]研究了干腌肉制品加工過程中LOX活力變化，表征了粗酶的變化及其活性；此外，Gata等[22]通過復(fù)雜的純化步驟從豬股二頭肌中分離得到一種LOX，初步研究顯示其可能參與伊比利亞火腿的風(fēng)味形成。本研究運(yùn)用基因重組技術(shù)將豬肉12-LOXcd基因克隆到表達(dá)載體pMBP，并導(dǎo)入到大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，成功構(gòu)建pMBP-12-LOXcd的大腸桿菌表達(dá)體系；通過Ni-NTA親和層析和凝膠過濾層析，最終獲得了高純度的12-LOXcd，并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在以亞油酸為底物時(shí)，豬肉12-LOXcd受溫度、pH值和NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的調(diào)節(jié)，其最適反應(yīng)溫度為30 ℃，最適pH值為6.0，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%時(shí)活性最高，并且在較高NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)下仍保持較高活性。因此，通過調(diào)節(jié)肉品加工過程的加工條件可以調(diào)控LOX活性及脂質(zhì)酶促氧化的進(jìn)程。