■王 貝 李斌昌 董利鋒 許貴善 賈夢可 侯長樂 刁其玉*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京100081；2.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，新疆阿拉爾843300）

甲烷是導(dǎo)致全球變暖的主要溫室氣體之一，排放總量低于CO2，等體積甲烷的溫室效應(yīng)是CO2的20～25倍[1]。反芻動物甲烷年排放量約8.0×107t（Kebreab 等2008），占人為甲烷總排放量的33%，其中牛和羊是最大的排放源。而反芻動物瘤胃甲烷排放量占全腸道排放總量的94%，后腸道發(fā)酵產(chǎn)生的甲烷僅占6%[2]。因此，減少甲烷能損失可降低攝入總能損失，科學(xué)合理的甲烷減排技術(shù)是持續(xù)緩解反芻動物甲烷排放的關(guān)鍵。郭雪峰等[3]、樊霞等[4]使用SF6示蹤法分別測定了內(nèi)蒙古白絨山羊和肉牛的甲烷產(chǎn)量。大量研究證明，SF6示蹤法可快速測定反芻動物甲烷產(chǎn)量。然而鮮有針對于泌乳中期奶牛甲烷排放量的報道。泌乳中期的奶牛，正處于妊娠早期，奶牛食欲旺盛，所攝入的營養(yǎng)足以支持產(chǎn)奶需要和維持體重，但因受內(nèi)分泌的影響，產(chǎn)奶量開始逐漸下降。這時應(yīng)維持奶牛飼養(yǎng)水平，保持泌乳量平穩(wěn)。試驗通過營養(yǎng)性調(diào)控減少甲烷排放，提高能量利用率，從而達到有效持續(xù)緩解反芻動物甲烷排放的目的。本試驗通過調(diào)整飼糧配方，采用SF6示蹤法測定泌乳中期奶牛瘤胃甲烷排放量，旨在為泌乳奶牛甲烷減排，環(huán)境保護和建立我國反芻動物甲烷排數(shù)據(jù)庫提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗于2018年11月15日至12月24日在北京市房山區(qū)琉璃河鎮(zhèn)趙營村某奶牛場進行。

1.2 試驗設(shè)計

試驗選用處于泌乳中期，產(chǎn)奶量中等偏低的12頭健康荷斯坦奶牛，月齡（41.16±2.85）月、體重（649.54±18.44）kg、胎次（1.42±0.15）胎、泌乳天數(shù)（170.08±19.04）d、產(chǎn)奶量（18.46±0.89）kg/d，隨機分配到3組，每組4頭。飼養(yǎng)試驗進行28 d，包括14 d預(yù)飼期和14 d 正試期。在正試期的1～6 d 進行氣體代謝試驗，采用SF6示蹤技術(shù)測定瘤胃甲烷排放量；第7～10 d進行消化代謝試驗，采集TMR樣品和糞樣；第11～13 d采集牛奶樣品；第14 d在晨飼3 h后通過口腔采集瘤胃液樣品，用于后期測定揮發(fā)性脂肪酸及銨態(tài)氮。

1.3 試驗飼糧及飼養(yǎng)管理

試驗分為3 個處理組，即NDF/NFC 分別為1.44（低NDF組，簡稱低組）、1.65（中NDF組，簡稱中組）和1.82（高NDF組，簡稱高組）。其中高NDF組飼糧為試驗?zāi)翀鲲曃菇?jīng)典飼糧。在試驗前3 d連續(xù)記錄試驗牛產(chǎn)奶量。試驗全期采用TMR 飼喂，每天2 次，分別在每天07：00和19：00飼喂，整個試驗期內(nèi)記錄試驗?zāi)膛５牟墒沉考笆Ａ狭俊Ｃ刻?6：30 和18：30 采用管道式擠奶機擠奶2 次，散欄飼養(yǎng)，自由飲水。每天按時觀察奶牛的健康及精神狀況，包括采食、反芻、糞尿、乳房炎以及蹄病發(fā)病狀況并做好記錄。飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗期內(nèi)平均全天最高溫度9 ℃，最低溫度-6 ℃，平均溫度1.5 ℃；最高濕度66%，最低濕度21%，平均濕度43.5%。圈舍懸掛舔磚，每周六消毒1次，所有參試奶牛的飼養(yǎng)環(huán)境、飼喂方式、飼糧和飼喂程序均保持一致。

1.4 樣品采集與分析

1.4.1 SF6示蹤技術(shù)

SF6示蹤技術(shù)，最早用于研究牛在自由放牧?xí)r的能量代謝，又稱為甲烷無干擾測定技術(shù)，其原理是將已知滲透速率的SF6滲透管投入待測動物瘤胃內(nèi)，SF6與甲烷具有類似的物理性質(zhì)，可隨動物呼吸和噯氣一起排出體外，在測得采樣器內(nèi)SF6與甲烷的濃度后，根據(jù)已知的SF6釋放速率，即可推算出甲烷的排放速率。SF6示蹤技術(shù)對于個體動物和群體動物都適用，其最大的優(yōu)點是使試驗動物活動不受限制，可直接測定生產(chǎn)條件下動物的甲烷排放量，并在圈養(yǎng)和放牧條件下都適用，取樣測試方便。缺點是，SF6氣體也是一種溫室氣體，盡管當前用于試驗研究釋放的SF6遠低于其他排放源，但在使用過程中還是應(yīng)當合理控制SF6排放量。Johnson（1994）等通過大量試驗證明，SF6氣體對反芻動物和瘤胃內(nèi)微生物均沒有毒害作用，同時也不參與動物體和微生物代謝，也不與瘤胃內(nèi)其他物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。

試驗采用SF6示蹤技術(shù)測定泌乳中期奶牛瘤胃發(fā)酵甲烷排放量。在預(yù)飼期的第12 d 將滲透管使用獸用投藥槍投入試驗?zāi)膛Ａ鑫竷?nèi)，同時將氣體采集管路支持裝置和集氣罐支持墊佩戴于奶牛頭部和背部，以備適應(yīng)。于正試期的第1～6 d對奶?？诒侵車鷼怏w進行收集，氣體樣品連續(xù)收集24 h，時間為每天08：00至次日08：00。集氣罐在使用前檢漏，并抽至約-100 KPa，采氣后集氣罐的剩余壓力在-40 KPa 以上表明采樣成功。測定時將高純氮氣充入集氣罐使其為正壓，壓力約為120 KPa。

氣相色譜儀器準備和測定條件[4-5]：試驗所用到的氣相色譜儀（上分GC-126）配備FID 和ECD 檢測器，可一次進樣同時測定CH4和SF6；載氣為高純氮氣，流量40 ml/min；燃氣為高純氫氣，流量為30 ml/min；助燃氣為干燥壓縮空氣；色譜柱溫40 ℃；進樣口溫度150.0 ℃；FID 檢測器溫度150.0 ℃；ECD 檢測器溫度300.0 ℃；SF6標準氣（標準氣體，北京海普氣體有限公司，北京）濃度為6.518×10-8g/m3（即0.01 ppb）SF6和7.14×10-3g/m3（即10 ppm）CH4，填充氣為高純氮氣，SF6采用單點校正法進行標定；將氣體樣品經(jīng)過裝有定量閥的進樣器進樣，重復(fù)進樣3 次以上，峰面積偏差小于5% 時取平均值作為有效峰面積，套入標準曲線取對應(yīng)濃度值。并通過以下公式計算泌乳奶牛CH4產(chǎn)量：

式中：CH4為泌乳奶牛甲烷排放量(g/d)；SF6為滲透管的滲透速率(mg/d)；CH4(樣品)和CH4(背景)分別為泌乳奶牛樣品和背景中的CH4濃度，單位為ppm(注：1 ppm CH4=7.14×10-4g/m3CH4)；SF6(樣品)和SF6(背景)分別為泌乳奶牛樣品和背景中的氣體濃度，單位為ppt(注：1 ppt SF6=6.518×10-9g/m3SF6)；16.04 和146.06 分別是CH4和SF6的分子量。

1.4.2 消化代謝試驗

1.4.2.1 營養(yǎng)物質(zhì)消化率

采用酸不溶灰分法（4N-AIA）測定營養(yǎng)物質(zhì)消化率。在正試期內(nèi)每天記錄投料量和剩料量，計算干物質(zhì)采食量（DMI）。在正試期連續(xù)3 d采集各組TMR飼料樣，將各組飼料樣分別混合均勻后四分法縮樣，各取500 g，密封于自封袋中-20 ℃冷凍保存待測。在正試期的第7～10 d采用直腸取糞法連續(xù)收集糞樣16次，每頭牛每次收集糞樣100 g，采樣時間點分別為第7 d的7：00、11：00、15：00、19：00，第8 d 的8：00、12：00、16：00、20：00，第9 d 的9：00、13：00、17：00、21：00，第10 d 的10：00、14：00、18：00、22：00。每次取糞后按照每100 g鮮樣加10 ml 10%鹽酸固氮，混勻后密封于自封袋中-20 ℃冷凍保存待測。將采集的飼料樣置于105 ℃15 min 滅酶活后，與糞樣分別在65 ℃烘干48 h，回潮24 h后稱重，粉碎過40目篩后制成分析樣品保存待測。

TMR樣和糞樣中常規(guī)營養(yǎng)成分的測定方法：總能（GE）使用Parr-6400全自動氧彈量熱儀（北京東方圣隆達科技有限公司，美國）測定；粗蛋白質(zhì)（CP）含量使用KjeltecTMSampler 8420 全自動凱氏定氮儀（FOSS，蘇州安創(chuàng)儀器有限公司，丹麥）測定；粗脂肪（EE）含量使用ANKOMXT15全自動脂肪儀（南京瑤恩儀器設(shè)備有限公司，美國）測定；DM、NDF、ADF、Ash 含量指標參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》測定[6]；由于部分飼糧所含精料比例較高，NDF和ADF采用熊本海等[7]及Van Soest 等[8]報道的方法，用胃蛋白酶（Pepsin P7000, Sigma-Aldrich Co. LLC., USA）、熱穩(wěn)定α-淀粉酶（α-Amylase A4551, Sigma-Aldrich Co. LLC., USA）預(yù)先對飼料樣品酶解處理，再用中性洗滌劑和酸性洗滌劑進行洗滌；同時使用4N-AIA 法測定飼料和糞中酸不溶灰分含量計算各營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率，計算方法參照Zhong等[9]的公式：

1.4.2.2 產(chǎn)奶量及乳成分

試驗開始前3 d 準確記錄奶牛初始產(chǎn)奶量，正試期每天記錄每頭奶牛產(chǎn)奶量。計算試驗期間的平均日產(chǎn)奶量。在正試期結(jié)束前連續(xù)3 d 按照早晚1∶1 的比例取奶樣，取樣量為每天50 ml，奶樣添加萬分之六重鉻酸鉀用作防腐劑，4 ℃保存用于測定乳脂率、乳蛋白率、乳糖率和體細胞數(shù)。待奶樣采集完畢后及時送至北京奶牛中心乳品質(zhì)量檢驗站進行檢測。產(chǎn)奶凈能和奶牛能量單位通過以下公式計算：

產(chǎn)奶凈能NEL（MJ/kg）=0.550 1×消化能（MJ/kg）-0.395 8

消化能（MJ/kg）=GE（MJ/kg）×能量消化率（%）

奶牛能量單位(NND/kg)=NEL(MJ/kg)/3 138×1 000

代謝能（MJ/kg）=GE（MJ/kg）×表觀消化率（%）×0.82

4%標準奶量（FCM，kg）=M×（0.4+0.15×F）

式中：M——乳脂率為F的牛奶量(kg)；

F——牛奶的實際乳脂率(%)。

1.5 統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016進行初步整理后，采用SPSS 20.0軟件中one-way ANOVA模型進行單因素方差分析和方差齊性檢驗，差異顯著時用Duncan's法進行各組間多重比較，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著，0.05＜P＜0.10為存在差異趨勢。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧NDF/NFC對泌乳中期奶牛瘤胃甲烷排放量的影響

表2 飼糧NDF/NFC對泌乳中期奶牛瘤胃甲烷排放量的影響

由表2 可知，泌乳中期奶牛瘤胃甲烷排放量、甲烷能、甲烷/代謝體重、甲烷/干物質(zhì)采食量、甲烷/有機物采食量、甲烷/精料采食量、甲烷/粗料采食量、甲烷/NDF 采食量、甲烷/ADF 采食量、甲烷能/總能攝入量、甲烷能/產(chǎn)奶凈能、甲烷能/代謝能、甲烷能/消化能在3 個處理組間均有極顯著差異（P＜0.01）；低組、中組甲烷/產(chǎn)奶量極顯著低于高組（P＜0.01）；低組甲烷/標準乳量顯著低于高組（P＜0.05）。

2.2 飼糧NDF/NFC對泌乳中期奶牛營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

表3 飼糧NDF/NFC對泌乳中期奶牛營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響(%)

由表3 可知，低、中、高3 組飼糧總能分別為18.28、18.21、18.14 MJ/kg，表 觀 消 化 率 依 次 為87.34%、83.17%、81.30%；DM、GE、CP、EE、NDF、ADF、OM 表觀消化率在3 組間均差異不顯著（P＞0.05）；低NDF 組NFC 的表觀消化率顯著高于高NFF 組（P＜0.05）。

2.3 飼糧NDF/NFC對泌乳中期奶牛生產(chǎn)性能和飼料

轉(zhuǎn)化率的影響

2.3.1 產(chǎn)奶量低、中、高3組在試驗期內(nèi)產(chǎn)奶量無顯著差異（P＞0.05），4%校正乳也無顯著差異（P＞0.05）。單位總能攝入量的標準乳產(chǎn)量在數(shù)值相當，3 組間無顯著差異（P＞0.05）。

2.3.2 飼料轉(zhuǎn)化效率和日增重

表4 飼糧NDF/NFC對泌乳中期奶牛生產(chǎn)性能的影響

從表4 可知，低組和中組的飼料轉(zhuǎn)化率在數(shù)值上相當，低組較高組提高了13.16%，3 組間差異不顯著（P＞0.05）；日增重在3 組間差異不顯著（P＞0.05），低組較高組提高了32.08%，3 組間差異不顯著（P＞0.05）。

2.3.3 乳成分

表5 飼糧NDF/NFC對泌乳中期奶牛乳成分的影響

由表5可以看出，各試驗組間乳脂率、乳蛋白率、乳糖率、乳脂總量、乳蛋白總量在三組間均無顯著差異（P＞0.05）。乳糖總量隨著飼糧NDF/NFC 的提高而呈降低趨勢（0.05＜P＜0.10）。

3 討論

3.1 飼糧NDF/NFC對泌乳中期奶牛瘤胃甲烷排放量的影響

瘤胃微生物能將碳水化合物和纖維物質(zhì)轉(zhuǎn)化為可為反芻動物消化利用的揮發(fā)性脂肪酸，同時在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量二氧化碳、氫氣和甲烷。甲烷菌通過利用二氧化碳和氫合成甲烷從而降低瘤胃氫分壓，維持瘤胃正常pH值，提高纖維分解菌的發(fā)酵能。因此，甲烷菌的存在有益于纖維分解菌。飼糧NDF/NFC 的降低，有利于丙酸發(fā)酵，降低瘤胃pH 值，從而影響纖維分解菌和甲烷菌的活性，降低甲烷排放量。飼糧NDF的升高，使奶牛食入更多高纖維含量的細胞壁和更少的可溶性碳水化合物，發(fā)酵產(chǎn)生較高乙酸/丙酸，導(dǎo)致較高的甲烷排放量。大量研究表明，甲烷產(chǎn)量與乙酸、乙酸丙酸比例呈正相關(guān)關(guān)系，與丙酸呈負相關(guān)關(guān)系。

Lovett 等[10]研究發(fā)現(xiàn)隨著精料比例的升高，單位活體和胴體增重的甲烷產(chǎn)量極顯著的降低。Lovett等[11]的結(jié)果顯示，高精料組顯著提高了泌乳奶牛干物質(zhì)采食量和產(chǎn)奶量，單位標準乳的甲烷產(chǎn)量隨著精料比例的增加呈下降趨勢。Hindrichsen 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)奶量為20 kg/d的泌乳牛全粗料飼糧中的50%替換為精飼料后，胃腸道甲烷產(chǎn)量降低了18%。樊霞等[4]的研究結(jié)果表明，肉牛甲烷排放量隨著粗飼料稻草的增加而增加。本試驗中奶牛甲烷排放量隨著飼糧NDF 水平的升高而顯著升高，與上述研究結(jié)果相一致。

反芻動物干物質(zhì)采食量與甲烷產(chǎn)生量呈正相關(guān)關(guān)系。高采食量增加了瘤胃食糜的流通速率，底物與瘤胃微生物的作用時間減少，瘤胃微生物數(shù)量和發(fā)酵模式發(fā)生改變，可降低甲烷排放量。本試驗中，隨著飼糧NDF 水平的降低，試驗牛采食量由11.59 kg/d 增加至15.30 kg/d，甲烷排放量由399.80 g/d 降低至260.95 g/d，對應(yīng)的干物質(zhì)采食量的甲烷排放量也由34.50 g/(kg·d)降低至17.06 g/(kg·d)。Benchaar 等[13]研究了4 種不同干物質(zhì)采食水平對瘤胃甲烷產(chǎn)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲烷能釋放量隨干物質(zhì)采食量的增加而增加，而單位總能攝入量的甲烷能呈下降趨勢。郭雪峰等[3]研究發(fā)現(xiàn)甲烷排放量與干物質(zhì)采食量呈正相關(guān)關(guān)系。

3.2 飼糧NDF/NFC對泌乳中期奶牛營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的影響

飼糧精料比例的降低，相應(yīng)NDF 水平升高，會引起奶牛采食量的相對增加，同時縮短了飼料在瘤胃中的降解時間，加快食糜在胃腸道的流通速度，減少微生物與食糜的作用時間，降低瘤胃發(fā)酵程度，導(dǎo)致了營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率的降低，而瘤胃微生物則需要能量來進行自身的營養(yǎng)和繁殖，從而導(dǎo)致飼糧總能利用減少[14]。飼糧NFC 濃度的增加，有利于分解蛋白質(zhì)、淀粉的優(yōu)勢菌群的增加，提高微生物的發(fā)酵速率，從而提高飼糧能量利用率。易學(xué)武等[15]的研究結(jié)果表明，奶牛DM、CP、OM、NDF、ADF、Ca、TP 的表觀消化率均隨著飼糧精粗比的增加而顯著增加。本試驗中各組營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率隨飼糧NDF 水平的升高而降低，其中NFC 的消化率在3 組間差異顯著，這與史仁煌等[16]、Tjardes[17]的研究結(jié)果一致。

3.3 飼糧NDF/NFC對泌乳中期奶牛生產(chǎn)性能和飼料轉(zhuǎn)化率的影響

瘤胃微生物利用飼料供能將含氮物質(zhì)合成微生物蛋白，微生物蛋白是反芻動物獲取蛋白的重要來源，也是乳蛋白合成的主要來源。張林等[18]認為，飼糧NDF/NFC 水平的升高會降低能量的供應(yīng)速率，不利于微生物充分利用氮源，進而影響微生物蛋白和乳蛋白的合成。Lykkesfeldt 等[19]、Turk等[20]認為，泌乳奶牛長期產(chǎn)奶容易造成機體損傷，導(dǎo)致機體免疫力下降、患病率升高。飼糧NFC 為易發(fā)酵碳水化合物，在瘤胃中可被微生物快速降解為VFA，為反芻動物的維持和生產(chǎn)提供能量。Broderick 等[21]、Penner 等[22]研究發(fā)現(xiàn)高NFC飼糧可提高奶牛干物質(zhì)采食量，進而發(fā)揮奶牛高產(chǎn)性能。Overton等[23]研究發(fā)現(xiàn)，高NFC飼糧能顯著改善奶牛機體新陳代謝，提高奶牛干物質(zhì)采食量和產(chǎn)奶量。

隨著飼糧NDF/NFC 的降低，飼糧中能量水平和蛋白含量增加，血糖濃度升高且生糖氨基酸濃度也升高，這些都促使奶牛的產(chǎn)奶量和乳蛋白率的增加。本試驗中乳脂率及其總量、乳蛋白率及其總量、乳糖率及其總量在3組間均無顯著差異，但隨著精料比例的增加，有增加的趨勢，這種差異主要是由干物質(zhì)采食量和產(chǎn)奶量的不同所造成的，干物質(zhì)采食量決定了奶牛用于維持和生產(chǎn)的養(yǎng)分供給量。本試驗中干物質(zhì)采食量、產(chǎn)奶量的變化規(guī)律一致，均隨著飼糧NDF 水平的升高而下降，這與張小麗等（2006）、汪水平等（2007）、溫嘉琪等（2014）、朱芬花等（2017）的研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

在本試驗條件下得出如下結(jié)論：

①飼糧NDF/NFC能極顯著影響泌乳中期奶牛甲烷排放量和單位代謝體重的甲烷排放量。

②飼糧NDF/NFC 在1.44 到1.82 之間，對泌乳中期奶牛營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率無顯著性影響，但隨著飼糧NDF/NFC 的下降，營養(yǎng)物質(zhì)表觀消化率呈升高趨勢，其中NFC的消化率顯著升高。

③飼糧NDF/NFC 在1.44 到1.82 之間，對泌乳中期奶牛生產(chǎn)性能和日增重?zé)o顯著性影響。