曾志輝，王曉莉，葉艷瓊，王甜甜，蘇其利，詹紀(jì)春，申婕，曾茂君，趙明一*

缺血性心臟病（IHD）是全球嚴(yán)重的健康問題之一，具有極高的發(fā)病率和致死率［1］。在心肌缺血條件下，冠狀動脈供氧與心肌需氧之間的平衡被破壞，導(dǎo)致機(jī)體嚴(yán)重持續(xù)缺氧，最終血管代償失衡并造成不可逆性心肌形態(tài)和功能的損害，其中氧化應(yīng)激（OS）是主要病理改變之一［2］。OS是由于機(jī)體遭受嚴(yán)重刺激后使體內(nèi)代謝失常而驟然產(chǎn)生大量活性氧（ROS）［3］，其后氧化作用占據(jù)主導(dǎo)位置，通過中性粒細(xì)胞炎性浸潤、蛋白酶分泌增加、產(chǎn)生大量氧化毒性中間產(chǎn)物［4］、活化自噬、Ca2+超載、激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等機(jī)制［5］進(jìn)一步加重心肌缺氧，從而造成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致心肌功能減退而發(fā)展為IHD。

花旗松素（Tax）是一種生物黃酮類物質(zhì)，已有研究表明其因具有降血脂、降血壓等效應(yīng)，在心血管疾病防治中具有潛在應(yīng)用價值［6］。但目前關(guān)于Tax對受到OS損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞的保護(hù)作用機(jī)制尚未明了。有研究表明，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路可通過調(diào)節(jié)核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）/血紅素氧合酶1（HO-1）、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）等分子活性發(fā)揮抗OS作用，另一方面高遷移率族蛋白1（HMGB1）也與OS、炎性反應(yīng)、自噬等密切相關(guān)［7-8］。本文探討Tax對過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞OS損傷的保護(hù)機(jī)制，為OS損傷性疾病的新藥研發(fā)提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細(xì)胞系 大鼠心肌細(xì)胞株H9C2細(xì)胞由長沙維爾生物科技有限公司提供。

1.1.2 實驗儀器 蛋白質(zhì)電泳儀（美國Bio-Rad公司），轉(zhuǎn)膜儀（美國BD公司），高速離心機(jī)（德國艾本德股份公司），凝膠掃描成像系統(tǒng)（上海寶山顧村電光儀器廠），倒置顯微鏡、熒光倒置顯微鏡（日本Olympus公司），紫外分光光度計（上海江儀儀器有限公司），水平瓊脂糖電泳槽（北京六一生物科技有限公司）。

1.1.3 主要實驗試劑 DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（美國ScienCell公司），Tax（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司），Mito-Tracker Green（C1048，美國Molecular Probes公司），蛋白酶抑制劑（德國Merck公司），蛋白磷酸酶抑制劑（瑞士Roche公司），ROS熒光染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），RT-PCR試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），RT-PCR引物（南京金斯瑞生物科技有限公司），p38抗體（14064-1-AP）、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）1/2抗體（16443-1-AP）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）抗體（11023-1-AP）（美國proteintech公司），磷酸化p38（p-p38）抗體（9211S，美國CST公司），磷酸化ERK（p-ERK）1/2抗體、磷酸化JNK（p-JNK）抗體（SC-81502）（美國Santa Cruz公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 研究時間 本研究時間為2017年3月—2018年3月。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將H9C2細(xì)胞培養(yǎng)于含鏈霉素和氨芐西林雙抗和10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中。當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)密度達(dá)60%～80%時，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并對細(xì)胞進(jìn)行傳代處理。將H9C2細(xì)胞隨機(jī)分為對照組〔僅加入0.1%二甲基亞砜（DMSO）〕、H2O2處理組（加入200 μmol/ml H2O2處理12 h）、Tax+H2O2處理組（加入100 μmol/ml Tax預(yù)處理6 h，換液后加入200 μmol/ml H2O2處理12 h）、Tax處理組（加入100 μmol/ml Tax處理6 h）。

1.2.3 光學(xué)顯微鏡觀察對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組細(xì)胞形態(tài) 將對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組的H9C2細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至完全貼壁狀態(tài)后，分別進(jìn)行藥物處理，置于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.2.4 熒光倒置顯微鏡觀察對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組ROS熒光染色情況 將待測的對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組H9C2細(xì)胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至完全貼壁狀態(tài)后，分別進(jìn)行藥物處理，加入ROS綠色熒光染色試劑Mito-Tracker Green，避光孵育15 min，熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞染色情況并拍照。

1.2.5 RT-PCR法檢測對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、骨橋蛋白（OPN）、HMGB1 mRNA表達(dá)水平 用Trizol法提取各組H9C2細(xì)胞的mRNA，按照RT-PCR試劑盒說明書操作，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA并作為模板，檢測各組細(xì)胞中iNOS、OPN、HMGB1 mRNA表達(dá)水平，RT-PCR引物序列見表1。以β-actin引物序列作為內(nèi)參校正樣品Ct值，實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.6 Western blotting法檢測對照組、Tax處理組MAPK 信 號 通 路 p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK表達(dá)水平 按照Western blotting實驗操作流程，收集對照組及Tax處理組待測細(xì)胞，加入RIPA裂解、定量后取20 μl上樣進(jìn)行凝膠電泳。電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜60～70 min，用清蛋白在室溫下封閉30 min后加入一抗（p38抗體、JNK抗體、ERK1/2抗體）（1∶500稀釋），4 ℃搖床孵育過夜，室溫下加二抗（p-p38抗體、p-JNK抗體、p-ERK1/2抗體）（1∶2 000稀釋），孵育2 h后加入ECL化學(xué)發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍照，采用Image J軟件對電泳條帶進(jìn)行灰度分析，記錄 p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK 表達(dá)水平。實驗獨立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 使用GraphPad Prism 5.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料以（±s）表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組細(xì)胞形態(tài)對照組細(xì)胞為正常梭形（見圖1A），與對照組相比，H2O2處理組細(xì)胞出現(xiàn)肥大，呈圓形及不規(guī)則形狀（見圖1B），而Tax+H2O2處理組細(xì)胞形態(tài)接近梭形，細(xì)胞變圓及肥大程度較H2O2處理組輕，不規(guī)則形態(tài)細(xì)胞數(shù)量減少（見圖1C）。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 Primers sequences used for RT-PCR analysis

圖1 對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組細(xì)胞形態(tài)（×200）Figure 1 H9C2 cell cellular morphology of the control group，H2O2 treatment group and Tax+H2O2 treatment group

2.2 對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組ROS熒光染色情況 對照組綠色熒光極少且亮度較弱（見圖2A），H2O2處理組綠色熒光量較對照組明顯增多且亮度增強(qiáng)（見圖2B），而Tax+H2O2處理組較H2O2處理組綠色熒光量及亮度減弱（見圖2C）。

圖2 對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組ROS熒光染色情況（ROS熒光染色，×200）Figure 2 H9C2 cell ROS fluorescent staining pictures of the control group，H2O2 treatment group and Tax+H2O2 treatment group

2.3 對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組iNOS、OPN、HMGB1 mRNA表達(dá)水平比較 對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組iNOS、OPN、HMGB1 mRNA表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Tax+H2O2處理組iNOS mRNA表達(dá)水平低于H2O2處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Tax+H2O2處理組OPN mRNA表達(dá)水平低于對照組、H2O2處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Tax+H2O2處理組HMGB1 mRNA表達(dá)水平高于對照組、H2O2處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表2）。

表2 對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組iNOS、OPN、HMGB1 mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 2 The mRNA expression of iNOS，OPN，HMGB1 of the control group，H2O2 treatment group and Tax+H2O2 treatment group

表2 對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組iNOS、OPN、HMGB1 mRNA表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 2 The mRNA expression of iNOS，OPN，HMGB1 of the control group，H2O2 treatment group and Tax+H2O2 treatment group

注：H2O2=過氧化氫，Tax=花旗松素；與對照組比較，aP＜0.05；與H2O2處理組比較，bP＜0.05

組別 iNOS mRNA OPN mRNA HMGB1 mRNA對照組 1.182±0.694 1.054±0.398 1.028±0.287 H2O2處理組 2.098±0.281 1.439±0.198 1.259±0.219 Tax+H2O2處理組 0.690±0.038b 0.341±0.031ab 1.951±0.084ab F值 8.175 14.110 15.100 P值 0.019 0.005 0.005

2.4 對照組、Tax處理組MAPK信號通路p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK表 達(dá) 水 平 比 較Tax處理組MAPK信號通路p38表達(dá)水平低于對照組，p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見圖3、表3）。

圖3 Western blotting法檢測MAPK信號通路p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK表達(dá)水平的凝膠電泳圖Figure 3 Gel electrophoresis picture of p38，p-p38，ERK1/2，p-ERK1/2，JNK，p-JNK of MAPK signaling pathway detected by Western blotting

表3 對照組、Tax處理組MAPK信號通路p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of expression of p38，p-p38，ERK1/2，p-ERK1/2，JNK，p-JNK of MAPK signaling pathway between control group and Tax treatment group

表3 對照組、Tax處理組MAPK信號通路p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK表達(dá)水平比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of expression of p38，p-p38，ERK1/2，p-ERK1/2，JNK，p-JNK of MAPK signaling pathway between control group and Tax treatment group

注：p-p38=磷酸化p38，ERK=細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶，p-ERK=磷酸化ERK，JNK=c-Jun氨基末端激酶，p-JNK=磷酸化JNK

組別 p38 p-p38 ERK1/2 p-ERK1/2 JNK p-JNK對照組 74.04±0.53 4.98±0.01 54.48±0.27 26.94±0.25 55.60±1.22 16.86±0.14 Tax處理組 63.69±1.33 103.10±4.23 65.49±0.14 65.29±1.53 62.44±0.50 40.68±0.45 t值 7.235 23.190 35.910 24.710 5.193 50.330 P值 0.002 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 0.007 ＜0.001

3 討論

后基因組時代IHD仍然是備受全球關(guān)注的健康問題［9］。在生命氧化代謝活動過程中，機(jī)體不斷產(chǎn)生各種氧自由基（OFR）。在生理狀態(tài)下，體內(nèi)抗氧化防御體系可以清除體內(nèi)產(chǎn)生的少量OFR，而體內(nèi)的OFR過度產(chǎn)生或清除減少，造成ROS生成與抗氧化防御之間的平衡紊亂，即OS。OS可導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化，損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)，破壞細(xì)胞膜，可致核酸堿基修飾及核酸鏈斷裂，染色體破壞，引起細(xì)胞功能障礙。心肌缺血缺氧時，線粒體單電子還原增多、中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)等生理病理改變，造成OFR大量增多，ROS在心肌細(xì)胞中大量蓄積，促進(jìn)OS，而OS可通過損傷細(xì)胞膜，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、Ca2+超載，產(chǎn)生炎性遞質(zhì)，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞等機(jī)制造成心肌細(xì)胞損害，心功能受損，導(dǎo)致IHD的發(fā)生。Tax是一種黃酮類中草藥，相關(guān)研究表明其在心肌細(xì)胞中可抑制OS所致線粒體凋亡，同時可抑制還原型輔酶Ⅱ（NADPH）氧化酶產(chǎn)生ROS，抗OS，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用［10］。

為了探討Tax對H2O2誘導(dǎo)的大鼠心肌細(xì)胞株H9C2細(xì)胞OS損傷是否具有保護(hù)作用，本實驗將H9C2細(xì)胞分為對照組、H2O2處理組、Tax+H2O2處理組，通過觀察各組細(xì)胞形態(tài)、ROS熒光染色情況及iNOS、OPN、HMGB1 mRNA表達(dá)水平，驗證Tax對H2O2誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞OS的影響。結(jié)果顯示，與對照組細(xì)胞相比，H2O2處理后細(xì)胞形態(tài)變圓，出現(xiàn)肥大，同時ROS染色綠色熒光較對照組明顯增多且亮度增強(qiáng)，提示細(xì)胞內(nèi)的ROS水平明顯升高，表明H2O2處理H9C2細(xì)胞可以模擬OS表型；而Tax+H2O2處理組經(jīng)Tax預(yù)處理后細(xì)胞形態(tài)接近梭形，細(xì)胞變圓及肥大程度較H2O2處理組輕，不規(guī)則形態(tài)細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞形態(tài)得到改善，綠色熒光量及強(qiáng)度介于對照組和H2O2處理組之間，提示ROS水平明顯降低，Tax可以改善H2O2對細(xì)胞造成的形態(tài)學(xué)改變，并減少細(xì)胞內(nèi)OS水平。Tax預(yù)處理能減輕、逆轉(zhuǎn)H2O2所致的心肌細(xì)胞損傷，改善OS所導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷。

iNOS是非鈣依賴性酶，在正常狀態(tài)無表達(dá)，缺血、缺氧等可激活誘導(dǎo)iNOS mRNA的表達(dá)，持續(xù)翻譯合成iNOS，催化NO大量持續(xù)產(chǎn)生，iNOS催化生成的NO可發(fā)生快速氧反應(yīng)生成OFR，加重心肌細(xì)胞的損傷［11］。OPN是一種主要由巨噬細(xì)胞分泌的磷酸化糖蛋白，隸屬于近來被稱之為“細(xì)胞蛋白”的一組秘密大分子［12］。心臟中，OPN是一種新近發(fā)現(xiàn)的黏蛋白，在出現(xiàn)炎癥、損傷或應(yīng)激反應(yīng)時其分泌增加。OPN的異常表達(dá)參與了部分心血管疾病的病理進(jìn)程，OPN表達(dá)水平升高可引起T淋巴細(xì)胞的增殖活化并介導(dǎo)其趨化遷移，造成嚴(yán)重的心肌損傷，導(dǎo)致心功能衰竭［13］。HMGB1是一種高度保守的蛋白質(zhì)，可由壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞被動釋放，在細(xì)胞內(nèi)外均可以發(fā)揮生物作用［14］。在細(xì)胞核內(nèi)，HMGB1作為一種非組蛋白染色體結(jié)合蛋白參與包括轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)、細(xì)胞分化和發(fā)育多種生物過程［15］；在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，HMGB1能介導(dǎo)吞噬作用；在細(xì)胞外，HMGB1則作為損傷相關(guān)分子模式（DAMP）發(fā)揮作用，是最具特征性的DAMP分子［16］，能與其他細(xì)胞因子、趨化因子及病原相關(guān)性分子模式相互作用，參與適應(yīng)性免疫應(yīng)答、組織重構(gòu)、血管再生、促進(jìn)平滑肌細(xì)胞遷移及增殖以及介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞遷移活化［17-19］。本研究結(jié)果顯示，Tax+H2O2處理組iNOS mRNA表達(dá)水平低于H2O2處理組，OPN mRNA表達(dá)水平低于對照組、H2O2處理組，HMGB1 mRNA表達(dá)水平高于對照組、H2O2處理組，表明Tax可以激活HMGB1表達(dá)，抑制OS相關(guān)基因iNOS、OPN的表達(dá)，提示Tax可通過激活HMGB1表達(dá)，抑制OS相關(guān)基因iNOS、OPN的表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞修復(fù)OS損傷。

MAPK信號通路是將信號從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)的一種重要信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，包括ERK1/2、JNK/應(yīng)激激活蛋白激酶（SAPK）、p38及ERK5/大絲裂原活化蛋白激酶1（BMK1）4條途徑，這些途徑通過不同的細(xì)胞外信號傳導(dǎo)刺激上游激酶的磷酸化而被激活［20］。MAPK級聯(lián)激活是多種信號通路的中心，在許多細(xì)胞增殖相關(guān)信號通路中具有關(guān)鍵作用。已有研究表明，MAPK信號通路的激活可誘導(dǎo)下游分子的表達(dá)，發(fā)揮抗OS、促自噬、促凋亡等作用［21］。為進(jìn)一步探明Tax對抗OS的機(jī)制，本研究檢測了對照組、Tax處理組MAPK信號通路相關(guān)蛋白及其磷酸化蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示，Tax處理組MAPK信號通路p38表達(dá)水平低于對照組，p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK表達(dá)水平高于對照組，表明Tax可提高細(xì)胞內(nèi)MAPK信號通路蛋白的磷酸化水平，提示Tax可能通過激活MAPK信號通路，激活HMGB1表達(dá)，抑制OS相關(guān)基因iNOS、OPN的表達(dá)，發(fā)揮抗OS作用。

綜上所述，Tax可以改善H2O2對細(xì)胞造成的形態(tài)學(xué)改變并減少細(xì)胞內(nèi)OS水平，其機(jī)制可能通過激活MAPK信號通路，激活HMGB1表達(dá)，抑制OS相關(guān)基因iNOS、OPN的表達(dá)來發(fā)揮抗OS作用。