張豪潔 林琛琛

對乙酰氨基酚(APAP)誘導(dǎo)的肝損傷，通常是由于患者同時服用多種含APAP的藥物引起，主要特征在于誘導(dǎo)肝衰的進(jìn)程快(數(shù)小時至數(shù)天)，并且存在劑量效應(yīng)關(guān)系[1-2]。在動物模型中易于通過APAP誘導(dǎo)，因此APAP誘導(dǎo)的肝損已成為研究急性肝損傷和肝再生的常用模型[3]。

在APAP誘導(dǎo)的肝損傷的小鼠模型中，即使是亞毒性劑量的APAP也可引發(fā)肝臟miRNA和血清miRNA的顯著變化，而衡量肝衰竭指標(biāo)如ALT和AST保持不變[4-5]。影響細(xì)胞活性(包括增殖，分化和凋亡)的miRNA中，miR-152近年來引起了很大關(guān)注[6]。本研究觀察了miR-152在急性肝損傷過程中的作用。

材料和方法

一、實驗材料

8～10周齡雄性C57BL/6小鼠購于上海斯萊克動物實驗中心。APAP購于美國Sigma公司；全自動生化分析儀(SIEMENSADVIA，美國)；全自動脫水機(ASP300)、石蠟包埋機、脫蠟機等均為德國Leica公司產(chǎn)品。

二、APAP誘導(dǎo)肝損傷

小鼠禁食過夜，腹腔注射0.9%氯化鈉溶液或APAP(300mg / kg)。 在miR-152干預(yù)實驗中，將20只小鼠隨機分成4組。在APAP注射前24 h，運用Entranster TM-體內(nèi)轉(zhuǎn)染試劑以1000 nmol/kg的劑量靜脈內(nèi)分別注射miR-152 激動劑、拮抗劑以及相應(yīng)的陰性對照。 APAP給藥后24 h處死小鼠，收集血清和肝組織，部分肝組織立即固定在4%甲醛中進(jìn)行組織學(xué)分析，其余組織-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

三、血清ALT和AST測量

戊巴比妥鈉麻醉小鼠，眼球取血，1 500×g，4℃離心，取上清液，稀釋后，應(yīng)用全自動生化儀檢測ALT和AST。

四、RNA分離和實時熒光定量PCR

使用TRIzol試劑(Invitrogen)從小鼠組織中提取總RNA。用TaqMan miRNA試劑盒(Life Technologies)測定miR-152的表達(dá)，以Sno202為內(nèi)參。用PrimeScript RT試劑盒(Takara)合成cDNA。用SYBR Premix Ex Taq RT-PCR試劑盒(Takara)通過qPCR測定小鼠基因的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參。qPCR引物如下：IL-1β forward: 5′- TGTAATGAA-AGACGGCACACC；IL-1β reverse: 5′- TCTTCTTT-GGGTATTGCTTGG；TNF-α forward: 5′- TTCT-ATGGCCCAGACCCTCA；TNF-α reverse: 5′- TTT-GCTACGACGTGGGCTAC；IL-6 forward: 5′- GCT-ACCAAACTGGATATAATCAGGA；IL-6 reverse: 5′-CCAGGTAGCTATGGTACTCCAGAA；CCL2 forward:5′- GCTGCCGTCATTTTCTGC；CCL2 reverse: 5′- TCTCACTGGCCCGTCATC；GAPDH forward: 5′- CAGAACATCATCCCTGCATC；GAPDH reverse: 5′- CTGCTTCACCACCTTCTTGA。

五、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、APAP處理后miR-152高度誘導(dǎo)表達(dá)

APAP對肝實質(zhì)造成了嚴(yán)重?fù)p害(圖1)。與PBS對照組相比，APAP實驗組ALT和AST明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。與正常肝臟相比，APAP組肝臟miR-152水平明顯升高(1.004±0.05 比 2.300±0.33，P<0.05)。與PBS對照組相比，APAP實驗組血中miR-152水平升高了3倍(1.008±0.07 比 3.123±0.16，P<0.05)。

圖1 APAP誘導(dǎo)的肝損傷后miR-152的表達(dá)水平

二、miR-152的體內(nèi)過表達(dá)減輕了APAP誘導(dǎo)的肝損傷

通過miR-152特異性激動劑或拮抗劑控制體內(nèi)miR-152的表達(dá)水平，來進(jìn)一步闡明miR-152在APAP誘導(dǎo)的肝損傷中的作用。miR-152拮抗劑加重了APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞壞死(圖2)；血清ALT和AST水平進(jìn)一步證實了這個結(jié)果。而miR-152 激動劑處理后的小鼠肝細(xì)胞壞死程度減弱(圖3)，血清ALT和AST水平也降低?？傊?，以上數(shù)據(jù)證明miR-152體內(nèi)過表達(dá)減輕了由APAP過量引起的急性肝損傷，而miR-152拮抗劑在損傷過程中具有不利影響。

表1 不同組別轉(zhuǎn)氨酶變化

注：*P<0.05

圖2 miR-152拮抗劑加重APAP誘導(dǎo)的肝損傷

圖3 miR-152 激動劑減輕APAP誘導(dǎo)的肝損傷

討 論

研究表明，miRNA在肝損傷中具有雙重作用。一些miRNA促進(jìn)肝細(xì)胞增殖起到有益作用，但同時一些miRNA可加速肝細(xì)胞壞死[7-8]。本研究的目的是驗證miR-152在APAP肝毒性中的調(diào)節(jié)作用及其潛在機制。

本研究結(jié)果顯示，APAP處理后miR-152在肝臟和循環(huán)中的水平均顯著升高，表明在APAP細(xì)胞毒性條件下誘導(dǎo)了miR-152合成。miR-152 拮抗劑加重了APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞死亡，而miR-152激動劑可顯著減輕肝損傷，通過組織學(xué)染色和血清ALT和AST水平驗證了該結(jié)果。miR-152對APAP誘導(dǎo)的肝損傷的有益作用主要是通過抑制包括IL-1β、IL-6和TNF-α在內(nèi)的關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子表達(dá)。在本研究中，miR-152在APAP過量后可調(diào)控炎性細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平，提示miR-152在藥物誘導(dǎo)的肝損傷后對調(diào)節(jié)病理生理過程起重要的作用。miR-152激動劑可緩解肝損傷，為臨床上治療APAP誘導(dǎo)的肝損傷開辟了新思路。

研究表明，特定miRNA通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄水平來參與炎癥[9]。在本研究中，使用mir-152拮抗劑沉默miR-152后上調(diào)關(guān)鍵的促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α，加劇了APAP誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性；此外，miR-152 激動劑過表達(dá)miR-152后通過靶向抑制這些促炎細(xì)胞因子。

血清中某些miRNA的水平通常比傳統(tǒng)標(biāo)志物如血清ALT和AST出現(xiàn)更早、更敏感和特異[10]。APAP治療后檢測循環(huán)miR-152升高可能提供提示肝損傷的新miRNA生物標(biāo)志物。為驗證miR-152對患者診斷的效用，應(yīng)進(jìn)一步研究APAP過量后miR-152隨時間的變化關(guān)系。此外，需要進(jìn)一步探索血清miR-152與當(dāng)前肝損傷的標(biāo)志物的相關(guān)性。

總之，miR-152在APAP過量應(yīng)用中具有保護(hù)作用，為DILI發(fā)病機制的研究提供了新的見解。通過過表達(dá)miR-152調(diào)節(jié)APAP對細(xì)胞毒性作用是一種具有前景治療策略。