張磊 楊沐迪 董順 劉明秋

（1. 復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438；2. 上海博威生物醫(yī)藥有限公司，上海 201318）

蛋白質(zhì)糖基化對蛋白質(zhì)的構(gòu)象、溶解度、穩(wěn)定性、免疫原性以及生物學(xué)活性有較大影響［1］。根據(jù)不同的修飾位點，糖基化可分為N-端糖基化和O-端糖基化。對于單抗藥物而言，N-端糖基化是最重要的翻譯后修飾之一，該修飾起始于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，結(jié)束于高爾基體，與單抗穩(wěn)定性、生物學(xué)活性、半衰期和免疫原性有關(guān)［1］。常見的N-端糖基化修飾包括半乳糖基化、巖藻糖基化和Man5等，不同糖基化修飾的單抗與Fc受體結(jié)合能力不同，從而影響藥物的生物學(xué)活性。例如，通過半乳糖苷酶切掉單抗的半乳糖殘基后，單抗補體依賴的細胞毒作用（CDC）活性降低了25%，而高半乳糖基化的單抗能夠提高50%的CDC活性［2-3］。此外，具有巖藻糖基化的單抗會降低其抗體依賴細胞介導(dǎo)的細胞毒作用（ADCC）活性［4］。而Man5修飾的單抗不僅血清半衰期短，并且具有較強的免疫原性［5-6］，因此，在細胞培養(yǎng)過程中應(yīng)盡量降低Man5修飾。

在動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)抗體藥物過程中，不同宿主細胞、pH、溫度、DO（溶解氧）、二氧化碳分壓、氨氮濃度等都能影響糖基化修飾過程［7-8］。近年來，越來越多的研究開始關(guān)注添加物對單抗糖基化修飾的影響，如在細胞培養(yǎng)中加入天冬酰胺或N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）均能引起半乳糖基化降低［9-10］，而加入半乳糖、錳離子等可提高單抗半乳糖基化［11-13］。另外有研究顯示，添加錳離子或甜菜堿能降低Man5［14-15］。目前，針對單抗巖藻糖基化調(diào)控的報道較少，基本停留在基因工程改良細胞株階段。

本研究以表達單抗的CHO細胞為研究對象，在前期開發(fā)中其半乳糖基化和Man5均與原研藥存在較大差異。通過全因子設(shè)計（FFD），在搖瓶培養(yǎng)中考察半乳糖、尿苷、氯化錳和蛋白水解物對細胞生長、單抗產(chǎn)量和單抗糖基化的影響并建立糖基化調(diào)控模型。在此基礎(chǔ)之上，通過不同規(guī)模的反應(yīng)器培養(yǎng)驗證模型最優(yōu)條件。單抗藥物的糖基化調(diào)控是生物類似藥工藝研發(fā)的重點和難點，本研究通過FFD設(shè)計優(yōu)化單抗糖基化分布，從而為生物類似單抗藥物的糖基化調(diào)控提供重要科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 試驗用細胞株為CHO-K1細胞，表達抗核因子κ B受體活化因子配體單抗，由本公司提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 基礎(chǔ)培養(yǎng)基Fed-batch、流加培養(yǎng)基Feed 1、半乳糖、尿苷、氯化錳均購于Sigma-Aldrich公司。蛋白水解物購于Kerry公司。地諾單抗（Prolia，Amgen Inc）作為原研藥。

1.2 方法

1.2.1 種子細胞培養(yǎng) 從細胞庫中復(fù)蘇細胞，以0.5×106cells/ mL活細胞密度接種于搖瓶，置于36.5℃、130 r/min和5% CO2的搖床（瑞士科耐Kuhner公司）中培養(yǎng)。每3 d進行細胞傳代，作為試驗用種子細胞。

1.2.2 批次培養(yǎng) 取對數(shù)生長期細胞，以約0.5×106cells/ mL的活細胞密度接種至250 mL搖瓶中，接種體積為50 mL。通過JMP軟件設(shè)計2個中心點24全因子試驗，研究半乳糖（X1）、尿苷（X2）、氯化錳（X3）和蛋白水解物（X4）對單抗糖基化的影響。根據(jù)試驗設(shè)計進行搖瓶試驗。培養(yǎng)周期為14 d。每隔1 d取樣，進行細胞計數(shù)和生化分析。按廠商提供的補料方式進行流加補料。培養(yǎng)結(jié)束后收集培養(yǎng)液，于3 000 r/min離心5 min后，取上清，置于-80℃保存待用。

1.2.3 反應(yīng)器培養(yǎng)驗證 選取最優(yōu)模型條件進行1 L、3 L和15 L反應(yīng)器（Applikon）培養(yǎng)驗證，培養(yǎng)體積分別為0.5 L、1.2 L和8.0 L。反應(yīng)器參數(shù)設(shè)置：36.5℃，pH（7.0±0.15），DO 40%，轉(zhuǎn)速 180-250 r/min。通氣方式為Drill Hole Sparger，培養(yǎng)過程中不加堿。

1.2.4 測定和分析方法 通過ViCELL-XR細胞計數(shù)儀（Beckman Coulter）進行細胞計數(shù)和活率分析；氨氮濃度用Nova 400生化分析儀檢測（Nova Biomedical）；單抗產(chǎn)量采用POROS A/20色譜柱（2.1 mm×30 mm）進行高效親和色譜檢測；上清收獲液經(jīng)rProtein A親和層析柱純化后，用糖譜分析色譜柱AdvanceBio Glycan Map（2.1 mm×150 mm）進行單抗糖基化檢測，具體分離步驟見產(chǎn)品說明書。其中五聚高甘露糖型（YM）通過檢測直接得到，而半乳糖基化（YG）和巖藻糖基化（YF）通過公式計算得出［13］：

G0表示不含半乳糖殘基，G1表示含一個半乳糖殘基，G2表示含二個半乳糖殘基，G0F表示不含半乳糖殘基但包含一個巖藻糖殘基，G1F表示含一個半乳糖殘基和一個巖藻糖殘基，G2F表示含有二個半乳糖殘基和一個巖藻糖殘基。

2 結(jié)果

2.1 添加物對單抗產(chǎn)量和糖基化的影響

運用JMP軟件進行全因子試驗設(shè)計（Run1-18）并進行搖瓶培養(yǎng)，基于預(yù)試驗結(jié)果和Gramer［13］報道，試驗設(shè)計中X1和X2分別選擇40 mmol/L和8 mmol/L作為最高濃度，X3和X4根據(jù)本公司平臺和相關(guān)項目經(jīng)驗分別選擇4 μmol/L和15 g/L為最高濃度。全因子試驗設(shè)計和結(jié)果見表1，結(jié)果顯示不同組合的添加物濃度對單抗產(chǎn)量并無影響。但是糖基化分布受添加物濃度的影響有較大變化，其中YG（%）最低值和最高值分別為5.2和15.2，YF（%）最低值和最高值分別為85.1和91.9，YM（%）最低值和最高值分別為8.8和19.7。

表1 半乳糖、尿苷、氯化錳和蛋白水解物對單抗產(chǎn)量和糖基化的影響

2.2 全因子試驗設(shè)計分析

根據(jù)全因子試驗設(shè)計（Run1-18）結(jié)果（表1），采用JMP軟件分別對響應(yīng)變量YG、YF和YM進行最小二乘法分析建模。發(fā)現(xiàn)YG和YM出現(xiàn)失擬，需加入二次平方項；根據(jù)JMP軟件支持曲線擬合的特性，試驗增加隨機組Run19、Run20（評估系統(tǒng)誤差）和Run21加入模型。

各因素對YG、YF和YM的影響（P＜ 0.002）經(jīng)JMP軟件擬合得到的回歸方程模型分別為：

從式（1）可知，X1、X2和X3均對YG有顯著正向影響，但平方項X12系數(shù)為負，方程的拋物面開口向下，對于X1存在極大值點。式（2）顯示X4和二階交互X3X4能夠顯著提高YF，但X2和X3對YF有負向影響，需要控制X2和X3的濃度以降低對YF的不利影響。對于YM，X2、X3和X4有顯著負向影響（式3），但平方項X22系數(shù)為正，方程的拋物面開口向上，對于X2存在極小值點。

全因子試驗結(jié)果采用JMP軟件進行方差分析，結(jié)果（表2）顯示YG、YF和YM的回歸方程模型無失擬（Lack Of Fit）（P＞0.05），表明模型對實驗的擬合有效。調(diào)整R2（R2Adj）與相關(guān)系數(shù)R2接近且R2＞0.9，說明所有模型擬合度良好。

表2 回歸模型擬合度分析

原研藥的平均YG、YF和YM值分別為13.9%、93.0%和8.6%，而空白對照組（表1，Run1）為5.2%、89.4%和17.5%，兩者單抗糖基化分布分別相差8.7%、3.6%和8.9%。為了減少與原研藥糖基化修飾的差異，需要提高YG、YF并降低YM。根據(jù)式1，當(dāng)X1在20-25 mmol/L時YG有極大值，結(jié)合中心點實驗結(jié)果選擇最優(yōu)X1濃度為20 mmol/L。根據(jù)式2，當(dāng)X2在2-4 mmol/L時其Man5有極小值，選擇2 mmol/L作為最適X2濃度。結(jié)合式2和式3，當(dāng)X4為15 g/L時能最大化提高YF并降低YM。為了盡量減少X3對YF的不利影響（式2），通過JMP軟件進行求值，得到最優(yōu) X3的濃度為 1 μmol/L。該條件下 YG、YF、YM預(yù)測值分別為11.4%、90.9%和9.6%，與原研藥差距分別為2.5%、2.1%和1%。

2.3 添加物對細胞密度和YM的影響

在細胞培養(yǎng)生產(chǎn)過程中，活細胞密度是單抗產(chǎn)量的重要決定因素。為了考察不同添加物對最終活細胞密度的影響，將各實驗組（Run1-18）按添加物情況進行分組，并通過雙樣本t檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果（圖1）顯示添加X1實驗組（P=0.43）和添加X3實驗組（P=0.74）均不影響最終活細胞數(shù)，而添加X2實驗組（18.6±1.4）最終活細胞數(shù)低于無X2組（20.9±2.6）（P=0.04）。此外，添加X4實驗組（21.7±2.3）最終活細胞數(shù)高于無X4組（18.1±0.8）（P=0.01），該結(jié)果表明添加X4有利于細胞生長。

圖1 加入蛋白水解物對最終活細胞數(shù)的影響

Pacis等［14］報道過氨氮濃度和YM之間存在正相關(guān)性，因此有必要對培養(yǎng)過程中的氨氮濃度和YM之間關(guān)系進行系統(tǒng)的分析。根據(jù)模型優(yōu)化的結(jié)果（式3），高濃度X2會提高YM，將添加X2實驗組（5.6±0.75）和無X2組（3.9±0.56）的最終氨氮濃度進行雙樣本t檢驗，兩組存在顯著差異（P＜0.000 1），表明加入X2能顯著提高培養(yǎng)液中氨氮濃度（表3）。將收獲時氨氮濃度與YM進行作圖，發(fā)現(xiàn)有一定正相關(guān)性（圖2-A）。由于添加物X4可產(chǎn)生氨氮并降低YM，為了確認X2的影響，將添加X4的實驗組去掉，氨氮濃度（x）與YM（y）接近線性相關(guān)（y=0.285 5x+0.414 7，R2=0.815 1）（圖 2-B）。

2.4 反應(yīng)器培養(yǎng)驗證

選取最優(yōu)添加物濃度（X1為20 mmol/L，X2為2 mmol/L，X3為 1 μmol/L，X4為 15 g/L）在 1L、3L、15L反應(yīng)器（BR）中進行模型驗證，結(jié)果顯示不同規(guī)模反應(yīng)器之間細胞生長，細胞活率和單抗產(chǎn)量基本一致（圖3）。無X4條件（1L-BR*）其培養(yǎng)第8天之后活細胞數(shù)逐漸低于其他實驗組（圖3-A），但最終細胞活率維持較高（圖3-B）。另外，所有實驗組的單抗產(chǎn)量并無明顯差異（表4）。推測添加X4雖能提高活細胞數(shù)，但也會導(dǎo)致培養(yǎng)后期營養(yǎng)物質(zhì)缺失，因此后續(xù)試驗有必要對流加補料工藝進行進一步探討。不同規(guī)模的反應(yīng)器（1/3/15L-BR）中糖基化分布基本相同（表4），以15 L反應(yīng)器為例，其YG、YF、YM實際值分別為11.2%、91.4%和8.2%，其中YG和YF與模型預(yù)測值差異小于0.5%，而YM差異為1.4%。同空白對照組（Run 1）相比YG、YF分別提高了6.0%和2.0%，而YM降低了9.3%，說明添加物能夠有效改善單抗糖基化分布。無X4條件（1LBR*）相比于15 L反應(yīng)器其YF下降了6.9%，而YM提高了6.1%，該試驗結(jié)果與模型預(yù)測公式一致（表 4）。

表3 尿苷對氨氮濃度的影響

圖2 細胞收獲液中氨氮濃度和YM水平的關(guān)系，所有實驗組（A）與僅考慮X2實驗組（B）

圖3 不同反應(yīng)器規(guī)模中活細胞密度（A）和細胞活率（B）

表4 反應(yīng)器中單抗產(chǎn)量和糖基化分布

3 討論

生物類似藥相比新藥研發(fā)投資小，成功率高。歐洲藥品管理局在批準第一個生物類似藥-紅細胞生成素之后，陸續(xù)開始批準更多的生物類似藥［16］。面對競爭日益激烈的生物藥市場，如何快速獲得安全、有效的生物類似藥至關(guān)重要。而單抗糖基化修飾不僅影響單抗的結(jié)構(gòu)、活性以及藥代動力學(xué)，更是單抗藥物重要的質(zhì)量屬性，因此在細胞培養(yǎng)過程中需要嚴格控制。在本研究中，通過添加半乳糖、氯化錳和尿苷均能有效提高單抗半乳糖基化。但同時發(fā)現(xiàn)，較高濃度的半乳糖卻難以進一步提高單抗半乳糖基化，這與之前的報道一致。在Gamer等［13］的研究中，將半乳糖和氯化錳的濃度分別從40 mmol/L和0.016 mmol/L提高到100 mmol/L和0.04 mmol/L后，僅提高了2%半乳糖基化。另外較高濃度半乳糖會導(dǎo)致滲透壓升高，抑制細胞生長。不僅如此，St Amand等［12］發(fā)現(xiàn)，較高濃度的半乳糖和氯化錳還能影響蛋白產(chǎn)量，同時引起Man5增加。為了進一步提高單抗半乳糖基化的優(yōu)化空間，可以選擇半乳糖的替代糖源，Hossler等［17］發(fā)現(xiàn)松三糖或乳糖可提高半乳糖基化并降低Man5。

本研究發(fā)現(xiàn)較高濃度的尿苷可導(dǎo)致Man5增加。加入尿苷的搖瓶最終氨氮濃度偏高，并且伴隨著Man5的增加，說明氨代謝與Man5存在內(nèi)在聯(lián)系。該結(jié)果與Pacis［14］試驗結(jié)論一致。氨氮是尿苷最終分解代謝產(chǎn)物，濃度過高會加重氨代謝負擔(dān)，引起鳥氨酸積累從而導(dǎo)致Man5增加［15］。另外，氨氮對蛋白糖基化的影響因素還包括：（1）影響UDPGlcNAc轉(zhuǎn)運蛋白活性［18］；（2）提高細胞內(nèi)pH，影響高爾基體內(nèi)糖基化酶的活性［19］；（3）降低β-（1，4）半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶的表達，在細胞培養(yǎng)中添加15 mmol/L氨氮濃度能降低40%半乳糖基化［20］。因此用尿苷進行糖基化調(diào)控，需要摸索最適作用濃度。

蛋白水解物是蛋白經(jīng)過酶水解之后得到的多肽混合物，是一種常用的細胞培養(yǎng)添加劑［21］。本研究加入的蛋白水解物可促進細胞生長，且對單抗產(chǎn)量基本無影響，與之前Spearman［22］的研究結(jié)果一致，但該報道中蛋白水解物不影響蛋白糖基化。根據(jù)Ho等［23］的研究，蛋白水解物可提高半乳糖基化。而本研究所使用的蛋白水解物可提高巖藻糖基化并降低Man5。該現(xiàn)象可能與不同水解物的來源和生產(chǎn)工藝有關(guān)。通常認為，蛋白水解物能為細胞提供較好的氧化還原環(huán)境，使得細胞內(nèi)各個細胞器能夠正常工作。例如，加入具有抗氧化作用的還原性谷胱甘肽能降低Man5［15］。由于蛋白水解物產(chǎn)品存在批次差異，會導(dǎo)致最終單抗藥物質(zhì)量不穩(wěn)定，所以大多數(shù)生物制藥企業(yè)對蛋白水解物的使用持謹慎態(tài)度。但越來越多的水解物生產(chǎn)商推出了成分明確的蛋白水解物產(chǎn)品，如BD Recharge，該類水解物批間差異小，適合商業(yè)化生產(chǎn)。后續(xù)研究應(yīng)考察該類蛋白水解物對于糖基化修飾的影響。

4 結(jié)論

在重組CHO細胞培養(yǎng)過程中，通過加入半乳糖、尿苷和氯化錳能夠顯著提高半乳糖基化，其中尿苷過量會提高Man5。而添加蛋白水解物能降低單抗Man5并提高巖藻糖基化。本研究成功利用上述添加物將生物類似藥的糖基化水平調(diào)控至與原研藥相當(dāng)。本研究所使用的添加物對單抗產(chǎn)量基本無影響，卻能極大地改善單抗糖基化分布，適用于已有的細胞培養(yǎng)工藝基礎(chǔ)上進行糖基化調(diào)整。