王翠云 劉艷 劉允軍

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081）

隨著全球人口的增長(zhǎng)和氣候環(huán)境的變化，糧食安全問題是許多國家面臨的緊迫問題。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因作物并應(yīng)用于商業(yè)化種植，有助于解決糧食安全問題。自1996年轉(zhuǎn)基因作物商業(yè)化種植以來，全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積逐年增加，2017年轉(zhuǎn)基因作物種植面積達(dá)到1.898億hm2，帶來巨大的社會(huì)效益、經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益［1］。商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因事件一般都是從大量轉(zhuǎn)化事件中篩選得到。由于轉(zhuǎn)基因作物的安全性問題受到廣泛關(guān)注，商業(yè)化種植的轉(zhuǎn)基因作物都經(jīng)過嚴(yán)格的安全性評(píng)價(jià)，許多國家已經(jīng)出臺(tái)了一系列法規(guī)和管理方法。

在轉(zhuǎn)基因安全評(píng)價(jià)中，外源基因在基因組中的整合位點(diǎn)是必須提供的信息。鑒定外源基因在基因組中的整合位點(diǎn)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的應(yīng)用具有重要意義。目前，主要通過PCR技術(shù)鑒定外源基因的整合位點(diǎn)，包括TAIL-PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR）、反向PCR（Inverse PCR，I-PCR）、T接頭 PCR（T-linker PCR）等方法［2-6］。TAIL-PCR 技術(shù)簡(jiǎn)單易行，反應(yīng)高效靈敏，產(chǎn)物特異性好，重復(fù)性好，應(yīng)用較為廣泛。Xu等［7］通過TAIL-PCR方法分離了水稻轉(zhuǎn)基因事件Bt-ZJ22中外源基因整合位點(diǎn)3'端旁側(cè)序列，并根據(jù)旁側(cè)序列建立了TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR鑒定方法。Yang等［8］通過TAIL-PCR方法鑒定了轉(zhuǎn)基因番茄華番l號(hào)外源基因整合位點(diǎn)的旁側(cè)序列。Liu等［9］對(duì)抗除草劑轉(zhuǎn)基因玉米事件Aro203進(jìn)行分析，鑒定了外源基因整合位點(diǎn)兩側(cè)旁側(cè)序列，并建立了事件特異性的PCR鑒定方法。

基于PCR技術(shù)獲得的旁側(cè)序列相對(duì)較短，如果旁側(cè)序列比對(duì)到多條染色體，則不能通過旁側(cè)序列確定外源基因整合的染色體。對(duì)外源基因進(jìn)行遺傳定位，可以確定外源基因在基因組中的物理位置，有助于全面了解外源基因在基因組中的整合情況。

本課題組前期將Cry1Ie和bar轉(zhuǎn)化玉米，獲得大量抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米新材料［10］。本研究以其中一個(gè)抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米事件IE34為研究對(duì)象，通過TAILPCR獲得外源基因整合位點(diǎn)上游旁側(cè)序列，并通過遺傳定位的方法確定外源基因整合的染色體位置，以期為轉(zhuǎn)基因玉米的安全性評(píng)價(jià)提供重要依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為轉(zhuǎn)Cry1Ie抗蟲玉米IE34。轉(zhuǎn)基因玉米與玉米自交系B73雜交構(gòu)建F2代分離群體用于遺傳定位。轉(zhuǎn)基因玉米材料申報(bào)在北京市和海南省的中間試驗(yàn)并進(jìn)行種植。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 取200 mg苗期生長(zhǎng)旺盛的玉米葉片，采用改良的CTAB法［11］提取DNA。

1.2.2 TAIL-PCR 依據(jù)Liu等［5］方法進(jìn)行TAILPCR，在外源基因的左邊界處設(shè)計(jì)特異性引物與隨機(jī)引物組合進(jìn)行擴(kuò)增（TAIL-PCR的隨機(jī)引物為L(zhǎng)AD1-1和LAD1-2，巢式引物為AC1；根據(jù)CaMV35S polyA終止子序列設(shè)計(jì)特異性引物35S-0、35S-1和35S-2（表1））。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收，與T載體連接，隨機(jī)挑選5個(gè)陽性克隆進(jìn)行測(cè)序。

表1 TAIL-PCR引物

1.2.3 轉(zhuǎn)化體的特異性PCR檢測(cè) 利用抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米IE34的旁側(cè)序列以及外源片段中的CaMV35S polyA序列，設(shè)計(jì)引物（上游引物IE34F：5'-AGGGGCTCCTCTGTTGTTGTA-3'；下游引物IE34R ：5'-TCGCTCATGTGTTGAGCATATAA-3'），建立IE34事件及其衍生產(chǎn)品的定性PCR鑒定方法。反應(yīng)條件為 95℃ 5 min ；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃1 min，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min。

1.2.4 BSR-Seq分析 轉(zhuǎn)基因玉米IE34與自交系B73構(gòu)建的F2分離群體植株長(zhǎng)至5葉期時(shí)，用草銨膦涂抹葉片，5 d后，根據(jù)葉片受害情況鑒定轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株。分別取50株轉(zhuǎn)基因玉米和非轉(zhuǎn)基因玉米的葉片樣品進(jìn)行混池，提取RNA，送北京貝瑞和康生物技術(shù)股份有限公司建庫測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行BSA分析，初步確定外源基因在玉米基因組上的整合位點(diǎn)。

1.2.5 外源基因整合位點(diǎn)的初定位驗(yàn)證 在MaizeGDB（http：//www.maizegdb.org/）網(wǎng)站上下載初定位處的SSR標(biāo)記，通過PAGE凝膠電泳篩選出在綜31和B73雙親之間存在多態(tài)性的引物。然后以分離群體中非轉(zhuǎn)基因植株DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，硝酸銀染色，篩選交換單株，驗(yàn)證外源基因整合位點(diǎn)。

2 結(jié)果

2.1 TAIL-PCR擴(kuò)增與序列分析

前期通過Southern雜交確定轉(zhuǎn)基因玉米IE34中外源基因單拷貝整合［10］。以轉(zhuǎn)基因玉米IE34葉片基因組DNA為模板，非轉(zhuǎn)基因玉米綜31基因組DNA為對(duì)照，用5'端特異性引物與隨機(jī)引物組合進(jìn)行TAIL-PCR擴(kuò)增。在第2輪及第3輪PCR后，轉(zhuǎn)基因玉米IE34擴(kuò)增到一條特異性條帶，而非轉(zhuǎn)基因玉米綜31沒有擴(kuò)增到條帶（圖1）。

圖1 TAIL-PCR擴(kuò)增旁側(cè)序列

將第3輪PCR擴(kuò)增到的特異PCR產(chǎn)物回收并克隆到T載體，選取陽性單克隆進(jìn)行測(cè)序、比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列1-776 bp為玉米基因組序列，777-982 bp為外源基因的序列（圖2）。BLAST比對(duì)結(jié)果表明，1-776 bp的玉米基因組序列為重復(fù)序列，存在于玉米基因組的多條染色體上。

2.2 轉(zhuǎn)化體特異性PCR檢測(cè)方法的建立

依據(jù)5'端旁側(cè)序列的信息，分別在旁側(cè)序列和5'端載體序列上設(shè)計(jì)上游、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只有轉(zhuǎn)基因玉米IE34親本、雜種F1和后代及其葉片、種子的DNA能擴(kuò)增出312 bp特異性目的條帶，水、非轉(zhuǎn)基因植株和質(zhì)粒均無擴(kuò)增條帶（圖3），從而建立了轉(zhuǎn)基因玉米IE34的特異性PCR鑒定方法。

圖2 轉(zhuǎn)基因玉米IE34外源DNA整合位點(diǎn)5'端旁側(cè)序列

圖3 轉(zhuǎn)基因玉米IE34事件特異性PCR檢測(cè)

2.3 外源基因的定位分析

2.3.1 分離群體的構(gòu)建及分離比驗(yàn)證 外源基因整合位點(diǎn)旁側(cè)序列比對(duì)到玉米多條染色體。為了進(jìn)一步確定外源基因整合位點(diǎn)所在的染色體，構(gòu)建遺傳分離群體并進(jìn)行定位分析。標(biāo)記基因Bar與目的基因緊密連鎖，可以通過在葉片上涂抹草銨膦的方法區(qū)分轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米植株。將轉(zhuǎn)基因玉米IE34與自交系B73雜交構(gòu)建的F2代群體種植于田間，在苗期涂抹草銨膦后進(jìn)行抗性鑒定并統(tǒng)計(jì)分離比，卡方測(cè)驗(yàn)表明F2代群體抗性分離比符合3∶1（表2），表明轉(zhuǎn)基因玉米中只有1個(gè)外源基因的整合位點(diǎn)。

2.3.2 外源基因的定位 從F2代分離群體中隨機(jī)取50株轉(zhuǎn)基因植株和50株非轉(zhuǎn)基因植株的葉片構(gòu)建2個(gè)混池，提取葉片RNA。RNA樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后，運(yùn)用測(cè)序所得的SNP標(biāo)記進(jìn)行BSA分析。發(fā)現(xiàn)在第1和第5染色體上均有信號(hào)較強(qiáng)的峰（圖4），分別位于玉米第1染色體短臂36.2-51.7 Mb和第5染色體短臂2.74-7.77 Mb。

表2 轉(zhuǎn)基因玉米IE34 F2群體遺傳分離統(tǒng)計(jì)

圖4 BSR-Seq分析對(duì)外源基因整合位點(diǎn)的初定位

在 MaizeGDB網(wǎng) 站（http：//www.maizegdb.org/）下載BSR-Seq分析的2條染色體初定位區(qū)間的SSR引物，通過PAGE凝膠電泳篩選在雙親之間存在多態(tài)性的引物。其中第5染色體處的多態(tài)性引物有umc2539、umc2591和umc1679，第1染色體處的多態(tài)性引物有umc1403和phi109275。以分離群體中192個(gè)非轉(zhuǎn)基因植株的DNA為模板，驗(yàn)證BSRSeq分析得到的初定位區(qū)間，結(jié)果（表3）顯示，第1染色體處的標(biāo)記引物擴(kuò)增出2個(gè)親本以及雜合型3種條帶，第5染色體處的標(biāo)記引物只擴(kuò)增出親本B73以及雜合型2種條帶，說明外源基因的整合位點(diǎn)位于第5染色體。

表3 BSR-Seq初定位結(jié)果驗(yàn)證

在第5染色體定位區(qū)間內(nèi)篩選到3個(gè)InDel標(biāo)記引物，分別為INS.71312、INS.71373和INS.26044。通過對(duì)定位群體篩選將bar定位在INS.71373和INS.26044 2個(gè)標(biāo)記之間。進(jìn)而依據(jù)BSR-Seq結(jié)果分析這個(gè)區(qū)間內(nèi)SNP位點(diǎn)，通過測(cè)序篩選出具有多態(tài)性的SNP位點(diǎn)，得到SNP1-1和SNP5-6 2個(gè)SNP多態(tài)性位點(diǎn)。用這8對(duì)多態(tài)性引物對(duì)F2代群體中384個(gè)非轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)左側(cè)標(biāo)記檢測(cè)的交換單株從32株遞減到3株，右側(cè)標(biāo)記檢測(cè)到的交換單株呈現(xiàn)從23株到22株的遞減趨勢(shì)，說明外源基因位于SNP5-6與INS.26044 2個(gè)標(biāo)記之間，這兩個(gè)標(biāo)記分別位于第5染色體2.35和2.61 Mb的位置（圖5）。綜上所述，外源基因整合到了玉米第5染色體2.35-2.61 Mb約260 kb的區(qū)間內(nèi)。

圖5 外源基因整合位點(diǎn)的精細(xì)定位

3 討論

隨著轉(zhuǎn)基因作物研究的快速發(fā)展，需要對(duì)轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行有效監(jiān)管。在創(chuàng)制有育種價(jià)值轉(zhuǎn)基因新材料時(shí)，希望外源基因的整合不影響受體作物的有利性狀，而且沒有質(zhì)粒骨架整合到受體基因組中。因此，確定外源基因在受體基因組中的整合位點(diǎn)對(duì)轉(zhuǎn)基因作物安全性評(píng)價(jià)具有重要意義。檢測(cè)外源基因整合位點(diǎn)旁側(cè)序列的方法有多種，如TAIL-PCR、反向PCR、染色體步移技術(shù)等［12-14］。本研究采用TAIL-PCR方法獲得了轉(zhuǎn)基因玉米事件IE34中外源基因整合位點(diǎn)5'端的旁側(cè)序列，但是沒有獲得整合位點(diǎn)3'端旁側(cè)序列，表明TAIL-PCR方法也有局限性，擴(kuò)增不成功的原因可能是引物不匹配，或者旁側(cè)序列結(jié)構(gòu)復(fù)雜導(dǎo)致無法擴(kuò)增到目的條帶。

如果知道外源基因整合位點(diǎn)兩端旁側(cè)序列，可以建立三引物PCR方法鑒定純合轉(zhuǎn)基因植株及雜合轉(zhuǎn)基因植株［9，15-16］。雖然本研究沒有得到轉(zhuǎn)基因玉米IE34中外源基因整合位點(diǎn)下游旁側(cè)序列，但利用外源基因5'端的旁側(cè)序列建立了轉(zhuǎn)基因玉米IE34的特異性PCR檢測(cè)方法，便于對(duì)其轉(zhuǎn)基因后代進(jìn)行檢測(cè)。

Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)外源基因整合到轉(zhuǎn)基因玉米IE34基因組中的重復(fù)序列區(qū)。此重復(fù)序列存在于玉米基因組多條染色體上，因此無法確定外源基因所整合的染色體及具體位置。在構(gòu)建的F2代分離群體中轉(zhuǎn)基因玉米與非轉(zhuǎn)基因玉米呈現(xiàn)3∶1的分離比，表明外源基因在玉米基因組中只有一個(gè)整合位點(diǎn)，因此可以利用遺傳定位的方法對(duì)外源基因整合位點(diǎn)進(jìn)行定位，進(jìn)一步確定外源基因在玉米染色體上的位置。采用BSR-Seq對(duì)外源基因整合位點(diǎn)進(jìn)行初定位，確定外源基因整合在第5染色體。通過進(jìn)一步的精細(xì)定位確定外源基因的整合位點(diǎn)在玉米第5染色體2.35-2.61 Mb約260 kb的區(qū)間內(nèi)，但還需要通過其他方法來確定整合位點(diǎn)下游的旁側(cè)序列。Guo等［14］利用基因組重測(cè)序方法鑒定到轉(zhuǎn)基因大豆中外源基因整合位點(diǎn)的旁側(cè)序列。直接利用高通量測(cè)序的方法有可能鑒定到轉(zhuǎn)基因玉米IE34中外源基因整合位點(diǎn)的下游旁側(cè)序列。

4 結(jié)論

轉(zhuǎn)基因玉米IE34中的外源基因整合在5號(hào)染色體2.35-2.61 Mb約260 kb的區(qū)間內(nèi)，通過PCR可以特異性檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米IE34。