張圣良 楚肖肖 趙友興 孔凡棟 黃小龍

（1. 海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，?？?570100；2. 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海口 570100）

海洋微生物是海洋天然產(chǎn)物的主要來(lái)源之一。尤其是海洋真菌，遺傳背景復(fù)雜、代謝產(chǎn)物種類(lèi)豐富，已成為海洋微生物新天然產(chǎn)物挖掘的重要資源［1］。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，海洋真菌產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類(lèi)型多樣的新天然產(chǎn)物，包括萜類(lèi)、聚酮類(lèi)、肽類(lèi)、甾體、酰胺、脂肪酸、生物堿等。這些新天然產(chǎn)物呈現(xiàn)出包括抗菌、抗腫瘤、抗寄生蟲(chóng)、抗污損和抗病毒等多種生物活性［2］，引起了國(guó)內(nèi)外眾多天然產(chǎn)物研究者的廣泛關(guān)注。

海洋真菌分布廣泛，棲息于海洋的各種生態(tài)環(huán)境，包括海水、海底沉積物、海水漂浮木、海洋動(dòng)植物表面及內(nèi)部組織等［3］。其中，海洋動(dòng)植物是海洋真菌的良好宿主，海洋真菌與這些宿主形成了附生、共生或者內(nèi)生的相互關(guān)系，這種相互影響不僅使海洋真菌產(chǎn)生與其他海洋真菌不一樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物，甚至還有可能產(chǎn)生與宿主相同或相似的活性物質(zhì)［4］。因此，近年來(lái)海洋共附生真菌已成為海洋微生物天然產(chǎn)物研究的熱點(diǎn)［5-6］。

海綿、珊瑚和海草是海洋底棲生長(zhǎng)的主要?jiǎng)又参锓N類(lèi)，是海洋生態(tài)系統(tǒng)中的重要生物種群，蘊(yùn)含著豐富的共附生真菌資源，并能產(chǎn)生豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物［7-8］。因此，對(duì)這三種海洋生物的共附生真菌種類(lèi)進(jìn)行廣泛深入地分離和研究，不僅對(duì)海洋環(huán)境的生態(tài)保護(hù)具有重要意義，也對(duì)發(fā)現(xiàn)與挖掘新的活性天然產(chǎn)物具有重要的利用價(jià)值?；诖?，本研究采集海南文昌近海域的海綿、石珊瑚和海草為研究對(duì)象，對(duì)其共附生真菌進(jìn)行分離、鑒定和抗菌活性分析，旨為這類(lèi)海洋共附生真菌資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 海草、海綿、石珊瑚樣品采集于海南文昌海域。樣品采集后，4 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩？咕钚灾甘揪航瘘S色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基配置 分離培養(yǎng)基Ⅰ：麥芽提取粉，20 g；陳海水，1 L；自然pH；瓊脂，20 g。分離培養(yǎng)基Ⅱ：葡萄糖，10 g；蛋白胨，5 g；KH2PO4，1 g；MgSO4·7H2O，0.5 g；陳海水，1 L；自然pH；瓊脂，20 g。分離培養(yǎng)基Ⅲ：蛋白胨，5 g；葡萄糖10 g；磷酸二氫鉀1 g；硫酸鎂0.5 g；瓊脂15 g；孟加拉紅0.03 g；蒸餾水1 000 mL；氯霉素0.1 g。抑制劑：100 mg/L的羧芐青霉素和鏈霉素（加入所有分離培養(yǎng)基中）。2號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基：麥芽提取粉，20 g；葡萄糖，20 g；酵母膏，5 g；蛋白胨，10 g；陳海水，1 L；自然pH。4號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基：甘露醇，20 g；葡萄糖，20 g；酵母膏，5 g；蛋白胨，10 g；KH2PO4，0.5 g；MgSO4·7H2O，0.3 g；陳海水，1 L；pH6.0。

1.2 方法

1.2.1 真菌菌株分離 將采集的海草、海綿和石珊瑚樣品分別用無(wú)菌水清洗三次，剪碎，取1 g置于無(wú)菌研缽中，加5 mL無(wú)菌水研磨成勻漿，吸取上清液按1∶10、1∶100、1∶1 000的比例稀釋?zhuān)∠♂屢?00 μL分別涂布于分離培養(yǎng)基上，28℃，培養(yǎng)3-5 d，挑取單菌落到PDA培養(yǎng)基上，反復(fù)純化。純化后的菌株分別保存于PDA斜面和-20℃的無(wú)菌甘油（20%）。

1.2.2 真菌菌株鑒定 純化得到的菌株根據(jù)平板上的形態(tài)特征進(jìn)行初步排重，選取形態(tài)特征差異較大的菌株做ITS序列分析。各菌株基因組DNA 提取及 rDNA-ITS 擴(kuò)增參照陳吉良［9］等 的方法。即取0.2 mL 10%（W/V）的Chelex-100 溶液加入到無(wú)菌的離心管中，再?gòu)钠桨迳咸羧【G豆大小的菌絲體置于Chelex-100 溶液中，在旋渦混合器上振蕩4-5 s至菌株與溶液混合，然后沸水浴10 min；冷卻至室溫之后，10 000 r/min離心10 min。取上清作為PCR擴(kuò)增的模板，PCR引物為ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。所得序列利用NCBI中BLAST在線(xiàn)比對(duì)服務(wù)進(jìn)行同源性比較分析，并確定菌株的種屬。

1.2.3 真菌菌株抗菌活性分析 分別接種菌株于發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)和4號(hào)中靜止常溫下培養(yǎng)30 d，三倍體積乙酸乙酯萃取3次，萃取液合并后經(jīng)減壓旋蒸濃縮得粗提物。將粗提物用甲醇配制成1 mg/mL濃度，10 000 r/min離心10 min。取10 μL的上清液加在直徑為6 mm 的濾紙片上，待濾紙片風(fēng)干后，貼在已分別接種了金黃色葡萄球菌和枯草桿菌的瓊脂營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基表面（菌體濃度1×106/mL），28℃培養(yǎng)1 d，采用十字交叉法測(cè)定抑菌圈直徑，重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 真菌的分離純化

本研究共采用了3種分離培養(yǎng)基對(duì)采集于海南文昌海域的10種海草、9種海綿和11種石珊瑚的共附生真菌進(jìn)行分離純化，一共獲得了113株純化的真菌。其中海綿中分離得到的菌株最多，為53株真菌，占比46.9%；石珊瑚次之，為42株真菌，占比37.2%；海草最少，為18株真菌，占比15.9%（圖 1）。

圖1 3種海洋生物中分離的共附生真菌所占比例

2.2 真菌的多樣性分析

通過(guò)形態(tài)排重，選取32株代表性菌株進(jìn)行了ITS序列分析。結(jié)果（表1）表明，32株真菌歸屬于3個(gè)門(mén)（子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)和半知菌門(mén)），8個(gè)目（叢梗孢目、曲霉目、絲孢目、殼霉目、盤(pán)菌目、球殼目、刺盾炱目和多孔菌目）和10個(gè)屬（枝孢屬、曲霉屬、地霉屬、青霉屬、擬青霉屬、籃狀菌屬、彎孢聚殼屬、偽壺?fù)?dān)菌屬、小囊菌屬和隔孢伏革屬），以及1個(gè)未定屬的炭角菌科。

其中9株菌屬于曲霉屬（Aspergillus），6株菌屬于地霉屬（Geotrichum），4株菌屬于彎孢聚殼屬（Eutypella），2株菌屬于枝孢屬（Cladosporium），1株屬于隔孢伏革屬（Peniophora），2株菌屬于青霉屬（Penicillium），1株菌屬于籃狀菌屬（Talaromyces），1株屬于小囊菌屬（Microascus），1株菌屬于擬青霉屬（Paecilomyces），1株菌屬于偽壺?fù)?dān)菌屬（Pseudolagarobasidium），1株屬于炭角菌科（Xylariaceae），1株屬于多孔菌目（Polyporales），2株屬于刺盾炱目（Chaetothyriales）。海綿樣品中分離的真菌種類(lèi)最豐富，10個(gè)屬的真菌都有分布。而石珊瑚和和海草樣品中分離到的真菌種類(lèi)最少。此外，曲霉屬真菌分離率最高，其他種屬則較低。

2.3 真菌發(fā)酵產(chǎn)物的的抗菌活性

采用兩種培養(yǎng)基對(duì)分離的真菌進(jìn)行靜置發(fā)酵，并分別提取發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抑菌活性分析。結(jié)果（表2）發(fā)現(xiàn)有12株真菌對(duì)兩種指示細(xì)菌顯示出不同程度的抑菌作用，并且在不同發(fā)酵培養(yǎng)基條件下對(duì)真菌代謝產(chǎn)物的抑菌能力產(chǎn)生一定的影響。其中，菌株 HNMF055、HNMF085、HNMF093和 HNMF095在2號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基上對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制活性相對(duì)較強(qiáng)。在4號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基上，菌株HNMF067和HNMF075則對(duì)枯草芽孢桿菌具有很強(qiáng)的抑制效果。而菌株HNMF073和 HNMF061和HNMF093在兩種發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)枯草芽孢桿菌都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性。此外，菌株HNMF067、HNMF055、HNMF085、HNMF088和HNMF103對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制作用，其中菌株HNMF088的抑制效果最強(qiáng)。

3 討論

本研究從海南文昌海域采集的海綿、石珊瑚和海草樣品中共分離到113株海洋真菌，鑒定了32株獨(dú)立的真菌。其中曲霉屬真菌是所有樣品分離率最高的類(lèi)群，這與前人的報(bào)道一致［10-15］。海綿樣品中除了分離到常見(jiàn)的Aspergillus屬和Penicillium屬真菌外，還分離出不常見(jiàn)的Cladosporium、Microascus、Paecilomyces、Talaromyces和 Xylariaceae， 以 及未 見(jiàn) 報(bào) 道 的Geotrichum、Eutypella、Peniophora、Pseudolagarobasidium等真菌。海草和石珊瑚樣品中除了常見(jiàn)的Aspergillus屬真菌，也發(fā)現(xiàn)不常見(jiàn)的Cladosporium屬和Talaromyces屬真菌?？傮w看來(lái)，這些海洋生物共附生真菌種類(lèi)豐富多樣，寄主既有普遍性，又存在特異性。其中曲霉屬真菌的寄主分布廣泛，而其他屬真菌的寄主則具有一定的特異性。曲霉屬真菌不僅是海洋最常見(jiàn)的真菌種類(lèi)之一，也是海洋新天然產(chǎn)物開(kāi)發(fā)的重要資源。據(jù)統(tǒng)計(jì)，該屬真菌能產(chǎn)生物堿、聚酮、甾體、萜類(lèi)、脂肪酸、鹵代物、糖苷、肽類(lèi)等結(jié)構(gòu)類(lèi)型多樣的天然產(chǎn)物，并呈現(xiàn)出多種生物活性，包括抑菌、抗癌、抗寄生蟲(chóng)和清除自由基等［16］，這些新天然產(chǎn)物正成為海洋藥物開(kāi)發(fā)的先導(dǎo)化合物。例如，海洋曲霉屬真菌Aspergillus ustus的天然產(chǎn)物halimide的衍生物plinabulin（NPI-2358），作為一種新型的血管阻斷劑抗癌藥，目前已經(jīng)進(jìn)入了III期臨床研究［17-18］。而其他稀有類(lèi)群海洋真菌的新天然產(chǎn)物在海洋真菌天然產(chǎn)物的研究中也占有重要地位［1］。因此，本研究分離到的113株海洋真菌中，既有常見(jiàn)的曲霉屬真菌種類(lèi)，也有稀有的如Pseudolagarobasidium等真菌類(lèi)群。目前還未見(jiàn)對(duì)該海域的海洋真菌的相關(guān)報(bào)道，預(yù)示這些共附生真菌在海洋天然產(chǎn)物的挖掘上具有潛在的利用價(jià)值。

表1 海草、海綿以及石珊瑚來(lái)源的32株真菌ITS序列的BLAST分析

此外，本研究采用兩種發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)分離菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果僅12株真菌的發(fā)酵產(chǎn)物表現(xiàn)出抗菌活性，且12株菌中大部分菌株的抗菌活性在兩種培養(yǎng)基呈現(xiàn)出較大差異，表明培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基種類(lèi)對(duì)海洋真菌代謝產(chǎn)物的表達(dá)具有重要影響。海洋真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因簇在實(shí)驗(yàn)室條件下大部分處于沉默狀態(tài)，環(huán)境條件的改變能夠使得某些沉默的基因得以表達(dá)從而產(chǎn)生不同的次生代謝產(chǎn)物［19］。因此，其它未表現(xiàn)出活性的菌株可能與選用的培養(yǎng)基不適宜有關(guān)，有待進(jìn)一步采用單菌株多次級(jí)代謝產(chǎn)物策略（One strain many compounds，OSMAC）［20］改變現(xiàn)有培養(yǎng)條件，激發(fā)沉默基因簇的表達(dá)，促使其產(chǎn)生更多結(jié)構(gòu)新穎、生理活性好的次生代謝產(chǎn)物。

表2 海草、海綿和石珊瑚共附生真菌的發(fā)酵產(chǎn)物在不同培養(yǎng)基下的抑菌活性分析

總之，本研究對(duì)海南文昌海域的海草、海綿和石珊瑚共附生真菌的多樣性進(jìn)行了初步探討，既分離到常見(jiàn)的曲霉屬真菌，也獲得比較稀有的其他真菌種類(lèi)；通過(guò)抗菌活性初篩，部分真菌的發(fā)酵產(chǎn)物具有良好的抗菌活性，這為后續(xù)海洋真菌活性代謝產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用研究奠定了基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究從海南文昌海域采集的海綿、石珊瑚和海草樣品中共分離到113株海洋真菌，鑒定了32株獨(dú)立的真菌，32株真菌歸屬于3個(gè)門(mén)（子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)和半知菌門(mén)），8個(gè)目（叢梗孢目、曲霉目、絲孢目、殼霉目、盤(pán)菌目、球殼目、刺盾炱目和多孔菌目）和10個(gè)屬（枝孢屬、曲霉屬、地霉屬、青霉屬、擬青霉屬、籃狀菌屬、彎孢聚殼屬、偽壺?fù)?dān)菌屬、小囊菌屬和隔孢伏革屬），以及1個(gè)未定屬的炭角菌科。采用兩種發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)分離菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，結(jié)果僅12株真菌的發(fā)酵產(chǎn)物表現(xiàn)出抗菌活性，且12株菌中大部分菌株的抗菌活性在兩種培養(yǎng)基呈現(xiàn)出較大差異，表明培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基種類(lèi)對(duì)海洋真菌代謝產(chǎn)物的表達(dá)具有重要影響。