汪 浩 ，汪 瑋 ，2，許文軍 ，2，施 慧 ，2，何 杰 ，2，謝建軍 ，2，王庚申 ，2

(1.浙江海洋大學(xué)海洋與漁業(yè)研究所，浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021；2.浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江舟山 316021)

殺香魚假單胞菌Pseudomonas plecoglossicida，最早由日本學(xué)者在香魚上發(fā)現(xiàn)，因其可引起香魚出血性腹水癥、致死率高而得名[1]。近年來，在我國浙東及福建等地沿海地區(qū)網(wǎng)箱養(yǎng)殖的大黃魚頻繁爆發(fā)一種疾病，死亡率達(dá)50%以上，該病以魚體脾、腎等內(nèi)臟器官出現(xiàn)大量白色結(jié)點(diǎn)為癥狀，被命名為內(nèi)臟白點(diǎn)病[2]。經(jīng)多位學(xué)者研究，證實(shí)引起大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病的病原為殺香魚假單胞菌[3-4]。目前，殺香魚假單胞菌引起的大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病每年均有不同程度的爆發(fā)，尚無有效的防治方法[5]，已成為威脅大黃魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要病原之一。

外膜蛋白定位于革蘭氏陰性細(xì)菌的表面，作為菌體與宿主接觸的第一界面，通?？梢鹚拗鞯奶禺愋悦庖叻磻?yīng)，具有良好的免疫原性，是亞單位疫苗開發(fā)中具有潛力的一類候選免疫原[6-7]。外膜蛋白A(OmpA)是一類具有跨膜結(jié)構(gòu)的外膜蛋白，在大腸桿菌中研究最為透徹，其主要功能是維持外膜的完整性，同時(shí)也參與病原對宿主的黏附、侵染、免疫防御和逃逸等功能[8-9]。已有研究表明，OmpA可增強(qiáng)菌體的致病力，是一個(gè)重要的毒力因子[10-11]，利用重組表達(dá)的OmpA作為免疫原在多個(gè)物種中均顯著提高了免疫后宿主的抵抗力和存活率[12-15]。本研究選取殺香魚假單胞菌基因組中存在的3個(gè)OmpA類蛋白，通過基因工程手段獲得原核表達(dá)的重組蛋白，并利用制備的殺香魚假單胞菌多克隆抗體對重組蛋白進(jìn)行免疫原性分析，旨在為殺香魚假單胞菌的外膜蛋白亞單位疫苗的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大黃魚源殺香魚假單胞菌株ZS1403001由本實(shí)驗(yàn)分離保存，大腸桿菌克隆感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自Takara公司，表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS購自全式金公司，原核表達(dá)載體pET30(a)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)蘭江風(fēng)博士惠贈(zèng)，pEasy-T載體購自全式金公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

制備多克隆抗體所用的SPF級新西蘭兔(♀)購自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重約1 kg。

1.1.3 試劑與儀器

主要試劑：高保真ExTaq聚合酶、DL2，000 DNA marker、細(xì)菌基因組提取試劑盒購自Takara公司，快速內(nèi)切酶、T4連接酶、Western Blot Kit購自全式金公司，膠回收和質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)MEGA公司，LB培養(yǎng)基、瓊脂糖、His標(biāo)簽蛋白純化柱購自上海生工生物公司，羊抗兔IgG-HRP購自索萊寶公司。

主要儀器：Applied biosystems 2720型PCR儀，伯樂(Bio Rad)核酸電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、Trans-Blot SD半干轉(zhuǎn)印槽，NanoDrop 2000c核酸分析儀、上海一恒THZ-100B恒溫?fù)u床、GHP-9080生化培養(yǎng)箱，華利達(dá)HS-800D水浴鍋，北京六一DYY-8C蛋白電泳儀。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank公布的殺香魚假單胞菌OmpA蛋白序列EPB94769.1(P1)，EPB94930.1(P2)，EPB95835.1(P5)，在基因組腳手架中找到對應(yīng)的編碼序列，用DNAMAN軟件對序列進(jìn)行分析，選擇適當(dāng)?shù)目寺∶盖形稽c(diǎn)，并通過Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。本研究設(shè)計(jì)的引物和各自攜帶的酶切位點(diǎn)信息如表1所示(序列下劃線部分為酶切位點(diǎn))。設(shè)計(jì)好的引物交由上海生工生物公司合成純化。

表1 本研究中使用的引物Tab.1 Primers used in this study

1.3 外膜蛋白基因的克隆

利用細(xì)菌基因組提取試劑盒對本實(shí)驗(yàn)室分離保存的殺香魚假單胞菌株ZS1403001進(jìn)行基因組抽提，以此作為外膜蛋白基因克隆的模板。根據(jù)表1所列引物特征選取合適的退火溫度(Tm)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 程序?yàn)椋?5 ℃，5 min；94 ℃，30 s，Tm，40 s，72 ℃，45 s，30 cycles；72 ℃，8 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定純度后進(jìn)行回收，回收產(chǎn)物與T載體相連、轉(zhuǎn)化DH5α。用抗生素平板作篩選，并用載體引物M13F/R作PCR驗(yàn)證，陽性轉(zhuǎn)化子送生工生物公司測序。測序結(jié)果比對無誤的克隆凍存于-80℃。

1.4 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

上述構(gòu)建好的T載體克隆經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒，經(jīng)NanoDrop2000c測定濃度后，與pET30(a)質(zhì)粒同時(shí)分別作BamHⅠ+HindⅢ雙酶切，酶切體系為：質(zhì)粒1 μg；快切酶buffer 5 μL；快切酶BamHⅠ和HindⅢ各1 μL；加ddH2O至50 μL。酶切溫度37℃，時(shí)間為30 min。酶切結(jié)束后，pET30(a)質(zhì)粒組加入1 μL CIAP酶繼續(xù)孵育1 h進(jìn)行載體去磷酸化。將兩組酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳區(qū)分條帶，回收各自對應(yīng)的目的帶，對回收產(chǎn)物作濃度測定。

將酶切回收產(chǎn)物中片段和載體按照摩爾比 (3～10)∶1混合、加入T4連接酶作連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，用卡那霉素平板作篩選，并用片段的F端引物與載體的R端引物進(jìn)行PCR檢測，陽性轉(zhuǎn)化子送上海生工生物公司進(jìn)行測序驗(yàn)證，序列經(jīng)比對無誤的克隆凍存于-80℃。

1.5 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

上述構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)，挑取單克隆在含卡那霉素的LB中培養(yǎng)至對數(shù)期，加入 IPTG 至終濃度為 0.4～1 mmol·L-1，轉(zhuǎn)移至 30 ℃恒溫?fù)u床，150 r·min-1誘導(dǎo) 5 h，離心收集菌體，加入 1/10 菌液體積的 buffer B 裂解液(8 mo·L-1尿素，100 mmol·L-1NaH2PO4·H2O，10 mmol·L-1Tris·HCl，pH=8.0)，常溫?fù)u床裂解 1 h，15 000 r·min-1離心 20 min，收集上清，取 20 μL 作 SDS-PAGE 電泳，根據(jù)電泳結(jié)果調(diào)整并選取最佳的IPTG誘導(dǎo)濃度。對于表達(dá)量低的重組蛋白，將其質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLysS感受態(tài)，嘗試通過抑制菌株的本底表達(dá)量來優(yōu)化表達(dá)。

經(jīng)優(yōu)化獲得最佳表達(dá)的菌株，通過500 mL錐形瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，收集的菌體用適量的Binding buffer(20 mmol·L-1Tris、250 mmol·L-1NaCl，pH=7.8)懸起，加入 1‰體積的溶菌酶，混勻后，經(jīng)-80 ℃凍融 1 次。超聲破碎菌體，離心收集上清，沉淀用buffer B裂解，通過SDS-PAGE分析重組蛋白在細(xì)胞中的存在位置。收集對應(yīng)位置的蛋白液，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，用鎳柱作蛋白純化。純化蛋白經(jīng)SDS-PAGE檢測大小和純度。

1.6 殺香魚假單胞菌多克隆抗體的制備

新西蘭兔飼養(yǎng)觀察1周，確定無異常后，耳靜脈采血，制備陰性對照血清。從-80℃保存的菌株ZS1403001取少量劃線接種于鹽度20的TSA平板，28℃培養(yǎng)48 h，挑取單克隆轉(zhuǎn)移至液體TSB培養(yǎng)基中，28℃，180 r·min-1培養(yǎng)至對數(shù)期，測定菌液濃度，加入5‰甲醛滅活24 h，取少量菌液涂板確認(rèn)滅活后，離心收集菌體，用生理鹽水洗滌3次，加入適量的生理鹽水調(diào)整菌液濃度至1.0×1011CFU·mL-1。

參考前人免疫方案[16-17]，稍作修改，具體如下：背部皮下多點(diǎn)注射免疫，首次免疫取0.5 mL 1.0×1010CFU·mL-1的菌體與等體積的弗氏完全佐劑混合后，分5點(diǎn)注射；間隔20 d后，取0.5 mL 1.0×1011CFU·mL-1的菌體與等量弗氏不完全佐劑混合注射；間隔10 d后，同樣劑量再次增強(qiáng)免疫1次；三免結(jié)束后間隔1周，耳靜脈采血，參照前人方法[18]通過ELISA測定血清抗體效價(jià)。

1.7 重組蛋白免疫原性的Western Blot檢測

上述純化獲得的重組蛋白用Bradford法測量濃度，取等量的重組蛋白P1、P2、P5，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，5%BSA封閉過夜，以制備的新西蘭兔抗殺香魚假單胞菌多克隆抗體作為一抗，羊抗兔IgG-HRP為二抗，孵育完成后，加入配制好的Western Blot顯色液顯色1 min后，拍照觀察，用Clinx圖像分析軟件(上海勤翔公司)對條帶濃度進(jìn)行對比分析。

2 結(jié)果

2.1 外膜蛋白基因克隆與重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以本實(shí)驗(yàn)室保存的殺香魚假單胞菌株ZS1403001的基因組作為模板，通過優(yōu)化PCR退火溫度，獲得P1，P2，P5的特異擴(kuò)增條帶，大小依次為 515 bp、728 bp、809 bp(含酶切位點(diǎn)，圖 1)，與預(yù)期大小一致。切取條帶回收后連接于T載體，用M13F引物測序，測序結(jié)果與NCBI序列比對，均為100%吻合，說明PCR過程無突變產(chǎn)生。將獲得的T載體克隆依次命名為P1T，P2T，P5T。

將上述T質(zhì)粒與pET30(a)載體同時(shí)分別用BamHⅠ和HindⅢ作雙酶切，酶切結(jié)果如圖2所示：P1T、P2T、P5T雙酶切可見2條帶，其中片段條帶大小與各自基因序列大小相吻合；pET30(a)載體雙酶切可見1條帶，相比酶切前電泳圖譜有明顯位移，說明酶切成功。酶切產(chǎn)物各自連接轉(zhuǎn)化DH5α后，PCR篩選陽性克隆并進(jìn)一步測序檢測，插入片段和位置均無誤的克隆依次命名為P1P，P2P，P5P。

圖1 外膜蛋白基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of the outer membrane protein gene

圖2 重組質(zhì)粒與pET30(a)載體雙酶切Fig.2 Double enzyme digestion of the recombinant plasmid and pET30(a)vector

2.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化

重組表達(dá)質(zhì)粒 P1P，P2P，P5P分別轉(zhuǎn)化 BL21(DE3)，挑取陽性克隆用試管作小量培養(yǎng)誘導(dǎo)，SDSPAGE結(jié)果顯示，P5P表達(dá)條帶顯著，P1P、P2P則無明顯表達(dá)。將P1P、P2P重新轉(zhuǎn)化BL21(DE3)pLysS，經(jīng)小量誘導(dǎo)，獲得顯著表達(dá) (圖3)，3個(gè)表達(dá)株的最佳IPTG 誘導(dǎo)濃度均為 0.4 mmol·L-1。

小量誘導(dǎo)獲得表達(dá)的3個(gè)菌株擴(kuò)大培養(yǎng)、誘導(dǎo)后，經(jīng)檢測，表達(dá)的蛋白均位于包涵體中。用鎳柱對收集的蛋白進(jìn)行純化，獲得的重組蛋白如圖3所示：P1，P2，P5條帶所在區(qū)間與理論預(yù)測的蛋白分子量(25 kD，32 kD，35 kD)一致。

圖3 重組蛋白純化前后電泳圖Fig.3 SDS-PAGE analysis of the recombinant protein before and after purification

2.3 殺香魚假單胞菌多抗的效價(jià)檢測

以甲醛滅活的殺香魚假單胞菌為抗原包被ELISA板，新西蘭兔免疫前血清為陰性對照，測定三免后收集的血清中抗體的效價(jià)。當(dāng)檢測孔的OD450讀數(shù)與陰性對照孔的讀數(shù)比值大于2.1時(shí)，視為陽性。如圖4所示，本實(shí)驗(yàn)制備的多抗效價(jià)達(dá)到1∶6 400以上，滿足后續(xù)Western Blot檢測等要求。

圖4 ELISA檢測兔血清抗體效價(jià)Fig.4 Analysis of the rabbit serum titer by ELISA

2.4 重組蛋白免疫原性分析

等量的重組蛋白P1、P2、P5經(jīng)PAGE電泳、半干法轉(zhuǎn)膜、抗體孵育、Western Blot顯色后，所得結(jié)果如圖5所示：P1，P2，P5均能與殺香魚假單胞菌兔抗產(chǎn)生特異結(jié)合，但結(jié)合強(qiáng)度存在顯著差異。用Clinx圖像分析軟件對3個(gè)免疫條帶的濃度進(jìn)行分析，結(jié)果以光密度值顯示，3個(gè)外膜蛋白的免疫原性由強(qiáng)到弱依次為 P5＞P2＞P1。

圖5 重組蛋白免疫原性的Western Blot檢測Fig.5 Immunogenicity analysis of the recombinant protein by Western Blot

3 討論

殺香魚假單胞菌作為大黃魚內(nèi)臟白點(diǎn)病的致病原，目前已公布基因組草圖信息[3]，這為通過反向疫苗學(xué)設(shè)計(jì)、篩選亞單位疫苗提供了可能性。外膜蛋白作為病原與宿主互作的關(guān)鍵因子，是極具潛力的候選免疫原之一。鄭宗林等[13]以嗜水氣單胞菌OmpA重組蛋白免疫斑點(diǎn)叉尾鮰Ictalurus punctatus，獲得高達(dá)85.71%的相對保護(hù)率，且免疫后魚體血清抗體水平顯著提高。LI Hui，et al[23]發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌和副溶血弧菌的OmpA存在交叉免疫作用并在鯉魚Cyprinus carpio免疫試驗(yàn)中有著良好的免疫保護(hù)率。本研究從已公布的大黃魚源殺香魚假單胞菌NB2011基因組中，選取了3個(gè)OmpA類外膜蛋白P1、P2、P5，其中P1含有與大腸桿菌OmpA的N端相似的結(jié)構(gòu)域(EMBL：IPR000498)，P2、P5則含有與大腸桿菌OmpA的C端相似的結(jié)構(gòu)域(EMBL：IPR006665)[21]。通過克隆及優(yōu)化表達(dá)發(fā)現(xiàn)，P5可在BL21(DE3)中被大量誘導(dǎo)，P1和P2在BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)量極低，而在抑制了背景表達(dá)水平的BL21(DE3)pLysS感受態(tài)中則能正常被IPTG誘導(dǎo)，說明P1和P2的表達(dá)可能對宿主菌存在一定的毒性。3個(gè)重組表達(dá)的蛋白經(jīng)鎳柱純化后均獲得了條帶單一的重組蛋白，說明本研究設(shè)計(jì)的克隆引物在重組蛋白中引入了正確的His標(biāo)簽序列。

如何快速、高效的從制備的抗原蛋白中，篩選出具有高保護(hù)效應(yīng)(高免疫原性)的抗原，是亞單位疫苗開發(fā)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵。為了降低疫苗篩選工作量，通?？稍趥€(gè)體免疫試驗(yàn)前，采用病原的抗體對候選抗原作免疫原性的初步篩選。對于魚類病原，由于現(xiàn)有的針對魚類抗體的商品化二抗產(chǎn)品相對稀少，給抗原的篩選增加了難度。VERJAN，et al[19]曾嘗試?yán)猛每箤t緩愛德華氏菌的抗原進(jìn)行篩選，獲得7個(gè)免疫原，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其中有4個(gè)免疫原均能與牙鲆的抗血清發(fā)生免疫反應(yīng)。CHEN Zijun，et al[20]利用小鼠的多克隆抗體對抽提的嗜水氣單胞菌外膜蛋白組分作初步篩選，并對篩出的抗原作進(jìn)一步魚體免疫試驗(yàn)，成功獲得一個(gè)保護(hù)率達(dá)71.4%的候選免疫原。上述研究均佐證了利用哺乳類抗體代替魚類抗體篩選魚類病原免疫原的可能性。本研究基于上述基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了通過殺香魚假單胞菌兔抗體對克隆表達(dá)的重組OmpA進(jìn)行免疫原性的初步分析試驗(yàn)。從初步的檢測結(jié)果看，P1、P2、P5的重組蛋白均能與殺香魚假單胞菌的兔抗體發(fā)生特異結(jié)合，說明3個(gè)重組外膜蛋白均帶有抗原表位，具備一定的免疫原性；同時(shí)，P2、P5與兔抗體的結(jié)合強(qiáng)度又顯著強(qiáng)于P1，這可能與3個(gè)蛋白各自所帶的結(jié)構(gòu)域有關(guān)：P2和P5帶有相似的結(jié)構(gòu)域，與大腸桿菌OmpA的C端同源，P1的結(jié)構(gòu)域則與大腸桿菌OmpA的N端同源。江年等[22]曾對多種革蘭氏陰性菌的OmpA結(jié)構(gòu)作生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，OmpA的N端結(jié)構(gòu)域在假單胞菌中變異性高，不同種的相似度僅為30%左右，這也部分揭示了P1免疫原性相對較弱的一種可能性——可能源于病原在進(jìn)化上形成的對宿主的免疫逃逸。

綜上，本研究為大黃魚源殺香魚假單胞菌免疫原的篩選提供了有益的參考，制備的3個(gè)外膜蛋白均顯示出一定的免疫原性，其中P2、P5免疫原性強(qiáng)，具有進(jìn)一步魚體免疫試驗(yàn)的價(jià)值。