王 怡，王 敏,王志波，林鵬程,3*

(1.青海民族大藥學(xué)院，青海西寧810007;2.青海省藥物分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810007;3.青藏高原植物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海西寧810007)

斑花黃堇（Corydalis conspersa Maxim）為罌粟科紫堇屬多年生草本植物，是生長在海拔4 300 m以上高寒流石灘中的青藏高原特色藥用植物[1]，全草用于治療瘟疫、燒傷、赤巴病(熱證)等，是重要的寒性藏藥藥材[2-3]?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)它具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗焦慮、保肝、殺蟲、抗腫瘤等活性[4-6]。普托品類生物堿主要存在于罌粟科、小檗科、馬兜鈴科等植物中。普托品可改善學(xué)習(xí)記憶能力，并可抑制AChE的活性。普托品的功效是活血通絡(luò)止痛，用于治療高血壓、坐骨神經(jīng)痛等疾病[7]，同時(shí)對于心血管疾病也有一定的作用[8]。目前國內(nèi)外的文獻(xiàn)中未見斑花黃堇中普托品含量的報(bào)道。本研究采用高效液相法建立藏藥斑花黃堇中普托品含量的測定方法，為深入研究斑花黃堇生物堿成分奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

儀器：Agilent 1100 series液相色譜儀（美國Agilent公司）；十萬分之一電子天平（上海梅特勒-托利多有限公司）；KH-300DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

普托品對照品（上海寶曼生物科技有限公司，HPLC≥98%）；甲醇（HPLC級色譜純，山東禹王有限公司）水為超純水。

斑花黃堇為2016年8月采于青?；ブ鄙剑?jīng)青海民族大學(xué)林鵬程教授鑒定為罌粟科紫堇屬斑花黃堇。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備

對照品溶液的配制：參考文獻(xiàn)[9]中溶液的配制方法，稱取普托品標(biāo)準(zhǔn)品8 mg，用提取藥材所用提取劑溶解，轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中，定容至刻度線。配制成濃度為0.8 mg/mL的普托品標(biāo)準(zhǔn)溶液，過0.45μm濾膜備用。

2.2 供試品品溶液制備

供試品溶液的制備：稱取斑花黃堇藥材粉末1.0 g，用50 mL甲醇、50 mL水、2.7 mL鹽酸配制成提取劑，在斑花黃堇藥材粉末中加入25 mL提取劑，超聲提取1 h。移取約2 mL溶液用0.45μm濾膜過濾，取濾液備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18柱(250 nm×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.1mol/L乙酸銨溶液-磷酸-氨水；檢測波長：285.16 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量10μL[10]。在上述條件下，達(dá)到較好的分離，R＞1.5，供試品與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖1和圖2。

圖1 普托品對照品的HPLC色譜圖

圖2 斑花黃堇樣品溶液的HPLC色譜圖

2.4 線性范圍的考察

由普托品的濃度和峰面積的積分值可得，普托品的濃度在0.05～0.80 mg/mL呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y=12 109X+76.19,R2=0.999 7，見表1。

表1 濃度與峰面積數(shù)據(jù)記錄

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取10μL 2.2項(xiàng)下的供試品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件，重復(fù)進(jìn)樣5次并記錄峰面積，計(jì)算峰面積積分值的RSD值。結(jié)果普托品的RSD值為1.86%，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

吸取10μL 2.2項(xiàng)下的供試品溶液，并按2.3項(xiàng)下確定的色譜條件，每隔2 h進(jìn)一次樣，記錄峰面積，根據(jù)峰面積的變化，確定供試品溶液在12 h內(nèi)的穩(wěn)定性，以峰面積積分值為指標(biāo)計(jì)算RSD值，考察供試品溶液的穩(wěn)定性。結(jié)果普托品的峰面積RSD值為1.30%，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定[11-12]。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

稱取5份斑花黃堇樣品，依據(jù)2.2項(xiàng)下的方法制得供試品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件，測定并記錄峰面積，計(jì)算普托品含量平均值為0.20 mg/mL，RSD值為1.60%，結(jié)果符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

吸取已知含量樣品溶液5.0 mL，共9份，分為3組，分別添加相當(dāng)于樣品含量的80%，100%，120%的普托品對照品[13-14]，按2.3項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算平均回收率為103.42%，RSD值為2.20%。表明分析誤差和操作過程中的損失少，該實(shí)驗(yàn)方法可靠。

2.9 斑花黃堇中普托品含量測定

吸取配制好的普托品對照品溶液5 mL于另外的10 mL容量瓶中，再用提取劑定容至刻度線，貼好標(biāo)簽注明濃度，依次稀釋，最后得到一系列濃度梯度(0.05、0.10、0.20、0.40、0.80mg/mL)。按2.3項(xiàng)下確定的色譜條件測定斑花黃堇中普托品的峰面積，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法[15-16]，計(jì)算普托品在斑花黃堇中的含量。結(jié)果表明普托品的含量為0.19 mg/mL。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測定藏藥材斑花黃堇中普托品含量，利用高效液相色譜分離良好、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)過程中，我們探究了多種流動(dòng)相對譜圖峰型的影響，最后得出甲醇-0.1mol/L乙酸銨溶液-磷酸-氨水作為流動(dòng)相峰型良好，基線平穩(wěn)。在此流動(dòng)相下得到標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖的出峰時(shí)間為14.2 min，在相同的色譜條件下得到樣品的色譜圖在14.2 min時(shí)有與標(biāo)準(zhǔn)品相對應(yīng)的峰。證明在斑花黃堇中含有生物堿普托品，由峰面積的積分值，采用外標(biāo)法測定的藏藥材斑花黃堇中普托品的含量為0.19 mg/mL，本實(shí)驗(yàn)的目的已經(jīng)達(dá)到，得出所需結(jié)果，為之后研究藏藥材斑花黃堇的生物活性奠定了基礎(chǔ)。