王瑞寧 , 趙孟孟 , 李存法 , 李青梅 , 張雨杭 , 王 麗 , 李金磊 , 郭軍慶 , 張改平,

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院 ， 河南 鄭州 450046 ； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室 ， 河南 鄭州 450002 ；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院 ， 河南 鄭州 450002 ； 4.河南省獸藥飼料監(jiān)察所 ， 河南 鄭州 450008)

豬瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV) 是豬瘟的病原，屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)成員之一[1]，該病屬于必須向世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)報(bào)告的傳染病，中國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將其列為一類動(dòng)物疫病[2]，主要臨床特征是稽留高熱、出血、母豬流產(chǎn)等，是一種嚴(yán)重危害世界養(yǎng)豬業(yè)的高致死性、烈性傳染病[3]。

目前對(duì)豬瘟防控尚無(wú)特效藥物，雖然使用豬瘟弱毒疫苗能夠很好的控制住豬瘟的大流行，但時(shí)常會(huì)有免疫失敗的報(bào)道，其中一個(gè)重要原因就是疫苗效價(jià)不足問題。通過PK-15、ST細(xì)胞等增殖CSFV來生產(chǎn)豬瘟疫苗，CSFV在細(xì)胞中增殖效價(jià)的高低及最終疫苗生產(chǎn)的質(zhì)量與對(duì)動(dòng)物免疫效果密切相關(guān)[4]。兔體定型熱反應(yīng)方法作為一種檢測(cè)豬瘟疫苗效價(jià)的傳統(tǒng)方法，但受家兔個(gè)體差異因素的影響，且操作繁瑣、耗時(shí)。半數(shù)細(xì)胞培養(yǎng)物感染量(TCID50)作為一種測(cè)定CSFV增殖滴度的方法較費(fèi)時(shí)費(fèi)力且受個(gè)人主觀判斷的影響[5]，因此，亟需快速、準(zhǔn)確測(cè)定CSFV增殖滴度動(dòng)態(tài)的方法。

本研究擬建立一種快速、敏感、特異的檢測(cè)CSFV的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法，分析CSFV在PK-15細(xì)胞上清中的增殖動(dòng)態(tài)，同時(shí)測(cè)定上清中的TCID50，并進(jìn)行比較，以便為研究快速檢測(cè)豬瘟疫苗效價(jià)及CSFV體外增殖規(guī)律等提供有效的理論依據(jù)。同時(shí)，通過該方法對(duì)CSFV在細(xì)胞上清中的增殖動(dòng)態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)來達(dá)到優(yōu)化接毒劑量、培養(yǎng)條件及CSFV最佳收獲時(shí)間的目的，且省時(shí)省力，為生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的CSFV疫苗及CSFV增殖機(jī)制的研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 病毒和細(xì)胞系 豬腎細(xì)胞(PK-15)、CSFV-Shimen(105.2TCID50/mL)，牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)，均由河南省農(nóng)科院動(dòng)物免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要儀器與試劑 凝膠成像儀、熒光定量PCR儀、核酸蛋白檢測(cè)儀等分別購(gòu)自Bio-Rad公司和ABI公司；感受態(tài)大腸桿菌DH5α、pMD-18T載體、SYBR Green-I Premix ExTaqTM熒光PCR試劑、RNA酶抑制劑、病毒RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及DNA分子量Marker，均購(gòu)自TaKaRa公司；DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，購(gòu)自Hyclone公司；胰蛋白酶，購(gòu)自Solarbio公司；瓊脂糖，購(gòu)自Invitrogen公司；引物合成及核酸測(cè)序工作由TaKaRa公司完成。

1.3 引物設(shè)計(jì) 據(jù)GenBank公布的CSFV Shimen毒株NS5A基因序列，用Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，其序列如下：上游引物: P1：5′-GCAGAAGCCCACCTC-GAGAT -3′；下游引物: P2：5′-TACACCGGTTCCTCCACTCC-3′，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物片段長(zhǎng)度149 bp。

1.4 病毒RNA的提取及cDNA的合成 病毒 RNA提取參照試劑盒說明書進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄 cDNA 的合成按照反轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV 說明書進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄后的cDNA置于﹣20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 將CSFVNS5A片段與pMD18-T的連接產(chǎn)物加至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑單個(gè)菌落純培養(yǎng)后提質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定后進(jìn)一步測(cè)序分析，用NanoDrop 2000測(cè)定陽(yáng)性質(zhì)粒質(zhì)量濃度，然后代入此公式Y(jié) (拷貝/μL)= [DNA 濃度X (g/μL) /DNA 長(zhǎng)度(bp)×660]×6.02×1023，計(jì)算濃度后即為標(biāo)品。

1.6 熒光定量PCR反應(yīng)的建立和優(yōu)化 用TaKaRa PremixExTaq試劑結(jié)合構(gòu)建的陽(yáng)性重組質(zhì)粒，初步優(yōu)化引物濃度及退火溫度等反應(yīng)條件。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將標(biāo)準(zhǔn)品用滅菌三蒸水10倍倍比稀釋后作為模板，采用建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線和熔解曲線的繪制。

1.8 熒光定量PCR檢測(cè)方法的評(píng)價(jià)

1.8.1 敏感性試驗(yàn) 按照1.6確定的反應(yīng)體系，將10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，該反應(yīng)檢出的最低模板濃度即為該方法的靈敏度。

1.8.2 特異性試驗(yàn) 在相同的條件下，對(duì)PCV2、BVDV提取核酸，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照為正常PK-15細(xì)胞混懸液，陽(yáng)性對(duì)照為CSFV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。上述樣品按照1.6確定的反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，確定該方法的特異性。

1.8.3 重復(fù)性試驗(yàn) 批間重復(fù)性試驗(yàn)：用所建立的方法對(duì)60 h、48 h、36 h三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)收集的CSFV細(xì)胞上清進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定，采用同樣的熒光定量PCR反應(yīng)條件進(jìn)行3次獨(dú)立的試驗(yàn)，每次試驗(yàn)間隔3 d；批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)：對(duì)60 h、48 h、36 h三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)收集的CSFV細(xì)胞上清，在同一試驗(yàn)中的同一反應(yīng)板上，采用同一反應(yīng)條件對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行3次熒光定量PCR檢測(cè)。

1.9 熒光定量PCR和TCID50體外增殖滴度測(cè)定比較

1.9.1 PK-15細(xì)胞培養(yǎng)及增殖CSFV 將PK-15細(xì)胞按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)成單層后，棄細(xì)胞生長(zhǎng)液，按培養(yǎng)液體積的10% 接種CSFV Shimen(105.2TCID50/mL)，置37 ℃ CO2培養(yǎng)箱吸附90 min 后，補(bǔ)加5 mL 2%維持液后繼續(xù)培養(yǎng)增殖病毒。

1.9.2 病毒液收集 按1.9.1陳述的方法用CSFV感染PK-15細(xì)胞，分別在感染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h收集病毒上清，12 000 r /min 離心5 min后用于病毒核酸提取。

1.9.3 病毒滴度的測(cè)定 對(duì)1.9.2不同時(shí)間收集的病毒上清液同時(shí)進(jìn)行TCID50測(cè)定，根據(jù)3次重復(fù)的結(jié)果，計(jì)算平均值，并根據(jù)平均值繪制病毒的體外增殖曲線。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的制備 采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒(圖1)核酸濃度，將DNA 拷貝數(shù)經(jīng)公式換算為1×1010拷貝/μL，并進(jìn)行10倍倍比稀釋，將1×108拷貝/μL～1×101拷貝/μL的陽(yáng)性質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品。

圖1 陽(yáng)性質(zhì)粒鑒定結(jié)果
M:DL-2 000 DNA Marker ； 1:NS5A陽(yáng)性質(zhì)粒 ； 2:陰性對(duì)照

2.2 熒光定量PCR反應(yīng)條件的建立及優(yōu)化 經(jīng)相關(guān)試驗(yàn)優(yōu)化后，確定最佳反應(yīng)體系為20 μL: 模板1.0 μL，上下游引物(10 μM)各0.5 μL，SYBR Premix ExTaq10 μL，補(bǔ)充滅菌三蒸水至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃，4 min；94 ℃，30 s；60 ℃，30 s；72 ℃，30 s，40個(gè)循環(huán)，最后制作熔解曲線。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)束后，生成標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，熔解曲線如圖3所示，其中標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率是3.173，截距是34.377，縱坐標(biāo)y軸為獲得的Ct值，橫坐標(biāo)x軸為對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)。由圖2可以看出，在較廣的范圍內(nèi)(1.0×101～1.0×108拷貝/μL)有很好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。熔解曲線分析結(jié)果表明，在80.0 ℃有一個(gè)擬合度非常好的單一峰，表明此引物是特異的，沒有引物二聚體或非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)(見封二彩版圖3)。

圖3 熒光定量Real-time PCR熔解曲線

2.4 敏感性試驗(yàn) 以10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品

圖2 熒光定量Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

(1×101～107拷貝/μL)為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，101拷貝/μL的cDNA仍能得到特異性擴(kuò)增，在101～107拷貝/μL線性范圍內(nèi)有良好的擴(kuò)增曲線(圖4)(101拷貝/μL檢測(cè)到的信號(hào)Ct值為30.91)。

圖4 熒光定量Real-time PCR的敏感性

2.5 特異性試驗(yàn) 從封二彩版圖5可以看出，只有CSFV陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品有明顯的特異性擴(kuò)增曲線，BVDV和PCV2和陰性對(duì)照檢測(cè)結(jié)果均為陰性，結(jié)果表明，本文建立的方法具有較好的特異性。

圖5 熒光定量Real-time PCR的特異性

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 對(duì)3個(gè)樣品批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，見表1和2。從表1可以看出，3個(gè)樣品的批內(nèi)重復(fù)的變異系數(shù)分別為0.90%，0.54%，0.70%，均小于1%；由表2可見，批間重復(fù)的變異系數(shù)分別為1.81%，1.1%，1.20%，均小于 2%；批內(nèi)、批間重復(fù)性試驗(yàn)變異系數(shù)均小于2%。

表1 熒光定量 PCR 批內(nèi)重復(fù)性

表2 熒光定量 PCR 批間重復(fù)性

2.7 熒光定量PCR和TCID50對(duì)CSFV細(xì)胞上清增殖滴度測(cè)定結(jié)果的相關(guān)性分析 取不同時(shí)間接毒后樣品，對(duì)其分別進(jìn)行熒光定量PCR和TCID50測(cè)定，并根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制曲線，見圖6和7。由圖6可以看出，8個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)收集的CSFV細(xì)胞上清液中的病毒含量從接毒后12 h到60 h隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)病毒拷貝數(shù)幾乎呈指數(shù)增長(zhǎng)，并在60 h(103.7TCID50/mL)時(shí)病毒拷貝數(shù)達(dá)到高峰，隨后呈下降趨勢(shì)；病毒滴度的變化從接毒后12 h(101.5TCID50/mL)開始到48 h隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，并在48 h(104.2TCID50/mL)時(shí)達(dá)到高峰，隨后逐漸開始下降，綜合圖6和7可以看出，雖然病毒滴度的測(cè)定結(jié)果與熒光定量RT-PCR結(jié)果在峰值上出現(xiàn)差異，但總體趨勢(shì)是一致的，都是先上升后下降。

圖6 CSFV石門毒株在PK-15細(xì)胞上清中的增殖曲線

圖7 CSFV石門毒株在PK-15細(xì)胞上清中TCID50的變化

3 討論

目前，弱毒疫苗免疫仍是控制豬瘟、減少經(jīng)濟(jì)損失的有效措施。CSFV細(xì)胞弱毒苗的病毒效價(jià)與疫苗的質(zhì)量密切相關(guān)，因此，在疫苗生產(chǎn)過程中，最佳的病毒收獲時(shí)間的確定是至關(guān)重要的，因此，掌握CSFV的增殖規(guī)律和收獲時(shí)間是生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)疫苗的前提。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)具有高敏感性、高特異性及操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)、基因表達(dá)研究和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)等諸多領(lǐng)域[6-8]。本研究建立檢測(cè)豬瘟病毒的SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法，在1×108～1×101拷貝/μL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，其敏感性達(dá)到101拷貝/μL，與王淑娟等[9]建立的方法(最低檢出量為10拷貝/μL)結(jié)果一致。重復(fù)性較好，批間、批內(nèi)變異系數(shù)均小于2%，且不與其他病毒發(fā)生交叉反應(yīng)。此外該方法比常規(guī)方法相比，因其不需要電泳等對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行后期處理，節(jié)省了一半的時(shí)間，其敏感性比常規(guī)的RT-PCR高約100倍[10]。

熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于CSFV 檢測(cè)，國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道。范斌等[11]從5′非編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物對(duì)豬瘟兔化弱毒疫苗病毒含量進(jìn)行了檢測(cè)，陳鍇等[12]從基因組3′非編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物建立了熒光定量PCR對(duì)豬瘟兔化弱毒疫苗效價(jià)進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果表明，熒光定量PCR與家兔熱反應(yīng)測(cè)定結(jié)果存在良好的相關(guān)性，可以用于豬瘟疫苗半成品中HCLV定量檢測(cè)。牛金鵬等[13]從5′非編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物建立了SYBR熒光定量PCR方法分析豬瘟石門強(qiáng)毒在急性感染期死亡豬體內(nèi)的分布情況。本研究對(duì)CSFV石門毒株體外復(fù)制動(dòng)態(tài)的研究首次采用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法，對(duì)不同接毒時(shí)間的PK-15細(xì)胞上清進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)測(cè)得的拷貝數(shù)，繪制CSFV在PK-15細(xì)胞上的生長(zhǎng)曲線，并與采用TCID50方法測(cè)得的數(shù)據(jù)繪制的動(dòng)態(tài)曲線進(jìn)行比較。為了保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取3個(gè)重復(fù)樣本，同時(shí)又進(jìn)行了3次獨(dú)立的重復(fù)試驗(yàn)，取最終的平均值繪制細(xì)胞上清中CSFV增殖動(dòng)態(tài)曲線。熒光定量PCR方法與TCID50檢測(cè)結(jié)果基本一致，熒光定量PCR方法測(cè)定的峰值與TCID50方法的峰值相比，推后了12 h，可能是由于TCID50方法測(cè)定的是活病毒粒子效價(jià)，而熒光定量PCR方法不同于TCID50方法，其檢測(cè)的是病毒核酸的含量，其中即含有感染性的活病毒核酸、有抗原性和免疫原性但無(wú)感染性的失活病毒核酸以及尚未完成病毒粒子裝配的核酸。本研究建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法具有很實(shí)用的應(yīng)用價(jià)值，雖然失去了感染能力，但其具有抗原性和免疫原性，可作為有效抗原成分存在于疫苗中。應(yīng)用兩種方法測(cè)得的CSFV的增殖曲線有一定的平行關(guān)系，但由于熒光定量PCR方法比TCID50方法更快速、敏感，更適用于生產(chǎn)過程中對(duì)CSFV增殖滴度的實(shí)時(shí)快速測(cè)定。徐興然等[14]采用間接免疫熒光染色檢測(cè)病毒抗原、Real-time PCR檢測(cè)病毒基因組RNA的增殖水平及病毒感染TCID50測(cè)定技術(shù)研究了CSFV在細(xì)胞上的增殖特點(diǎn)，本研究的結(jié)果與其結(jié)果一致，均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。王遵寶等[15]用間接免疫熒光染色檢測(cè)病毒抗原、Real-time PCR及兔體定型熱法對(duì)豬瘟兔化弱毒(ST細(xì)胞毒)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，可用Real-time PCR法替代傳統(tǒng)的兔體反應(yīng)熱法進(jìn)行豬瘟活疫苗檢測(cè)。

依據(jù)熒光定量PCR方法測(cè)定的CSFV增殖動(dòng)態(tài)，精確分析CSFV在細(xì)胞上清中的增殖動(dòng)力學(xué)規(guī)律，可以確定在PK-15細(xì)胞上最佳收毒時(shí)間，也為CSFV在PK-15細(xì)胞中的增殖動(dòng)態(tài)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)為保質(zhì)保量的豬瘟疫苗的生產(chǎn)提供了一定的科學(xué)依據(jù)。該檢測(cè)方法靈敏、特異、快速的檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)，為生產(chǎn)過程中的大規(guī)模增殖CSFV時(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)控病毒滴度等提供了一種有效手段，同時(shí)也為CSFV感染機(jī)制的研究、抗CSFV藥物的研制等提供了一定的幫助。