米熱阿依·亞力昆，迪那拉·恰熱甫汗，阿合爾扎馬尼·麥麥提，巴哈古力·阿卜都熱合曼，太力艾提·吐爾洪，巴吐爾·買買提明

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)維吾爾醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011；3.新疆醫(yī)科大學(xué)中心實驗室，烏魯木齊 830011)

肝細(xì)胞性肝癌簡稱肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC),近20 年病死率逐年升高[1-2]。肝癌發(fā)病率高、死亡率高，預(yù)后極差，在癌癥相關(guān)死亡率中位居第3位。數(shù)據(jù)顯示，80%的肝癌患者由肝硬化轉(zhuǎn)化而來，乙肝、丙肝、酗酒、黃曲霉素和化學(xué)致癌劑的接觸是其發(fā)病的主要原因[3-4]。其中化學(xué)致癌劑引起的肝癌占一定比例，而亞硝胺類誘導(dǎo)劑二乙基亞硝胺溶液(DEN)致癌率較高，是建立肝癌模型中常用的化學(xué)誘導(dǎo)劑[5-7]。DEN誘導(dǎo)肝癌的動物模型與臨床患者的組織學(xué)和遺傳學(xué)特征相似，此方法在肝癌模仿過程中較常用[8]。

代謝組學(xué)是研究體內(nèi)代謝產(chǎn)物的系統(tǒng)生物學(xué)方法，能為疾病狀態(tài)、藥理毒理和基因功能的研究提供大量信息[9-10]。目前，有研究利用代謝組學(xué)尋找肝癌的潛在生物標(biāo)志物，在肝癌的研究領(lǐng)域取得了成果[11]。

本研究采用DEN誘導(dǎo)大鼠肝癌模型，采用核磁共振波譜技術(shù)(1H-NMR)分析模型大鼠尿液中的小分子代謝物，闡述由DEN導(dǎo)致的體內(nèi)代謝變化機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1儀器 Inova 600 MHz型核磁共振波譜儀(美國Varian公司)；5 mm 核磁管(美國威爾瑪公司)。

1.2試藥 DEN(美國Sigma公司)；2，2-二甲基-2-硅雜戊烷-5-磺酸鈉(DSS)緩沖液(武漢安隆科訊公司)；超純水，Milli-Q系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.3動物 選擇SPF級健康SD雄性大鼠，體質(zhì)量180±20 g，隨機(jī)分為2組，即正常對照組(n=10)與肝癌模型組(n=9)，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d。實驗動物由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號：[SCXK (新) 2011-0004]。所有動物實驗程序均符合倫理學(xué)相關(guān)規(guī)定。

2 方法

2.1動物模型的制備 正常對照組大鼠按需飲用滅菌水，肝癌模型組大鼠按需飲用質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的DEN溶液造大鼠肝癌模型。連續(xù)飲用18周，每周稱定1次質(zhì)量，2組大鼠建模周期完成后的最后1天禁食但自由飲水，采集24 h尿樣，麻醉，取肝臟，置于多聚甲醛溶液中。

2.2動物肝臟病理切片 將肝臟樣本用40 g·L-1的通用型多聚甲醛固定；依次用體積分?jǐn)?shù)為70%，80%和100%的乙醇梯度洗脫，二甲苯透明，組織塊浸蠟和包埋，將包埋好的組織切片，HE染色，在顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)改變。

2.3尿液核磁共振檢測 將尿液樣品以12 000 r·min-1離心10 min，取450 μL上清液，加入DSS緩沖液50 μL至5 mm核磁管中，采用Inova 600型核磁共振波譜儀調(diào)用NOESYPRESAT1D脈沖序列進(jìn)行核磁共振氫譜的測定。水峰采用飽和時間為2 s的預(yù)飽和方式壓制，參數(shù)設(shè)置為采樣點數(shù)：32 k，譜寬：10 000 Hz，掃描次數(shù)：128次，測試時間：1.64 s，測試溫度：25 ℃。為識別和鑒定圖譜中的峰，對部分樣本進(jìn)行了核磁共振二維譜檢測，包括質(zhì)子全相關(guān)譜(Total correlation spectroscopy，TOCSY)，H-H同核相關(guān)譜(1H-1H Homonuclear correlation spectroscopy，1H-1H COSY)和J-分解譜(J-resolved spectroscopic，J-RES)等。

2.4圖譜處理和統(tǒng)計學(xué)分析 對所有核磁共振氫譜進(jìn)行相位及基線調(diào)整，并用指數(shù)窗函數(shù)進(jìn)行處理，其增寬因子為0.5 Hz。DSS緩沖液作為內(nèi)標(biāo)，其化學(xué)位移定為0 ppm?；瘜W(xué)位移在0～10 ppm范圍內(nèi)將圖譜分成3 367段進(jìn)行自動積分，每段為0.003 ppm；因尿液中的水信號對分析結(jié)果有干擾，因此除去δH=4.95～4.70 ppm范圍的水峰信號。剩余的信號積分值進(jìn)行歸一化，采用SIMCA-P軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行正交偏最小二乘判別分析(Orthogonal partial least-squares discriminant analysis，OPLS-DA)，PLS模型(偏最小二乘法)的外部驗證采用200次的排列驗證試驗，以便判斷分析模型的有效性。代謝物在2組中的差異性采用OPLS-DA分析中的VIP值來判斷，將沒有采用的r值刪除。差異性代謝物參與的代謝通路采用MetaboAnalyst 3.0進(jìn)行分析，影響因子(pathway impact)>0.1和-log(p)>3的代謝通路被認(rèn)為是2組中差異明顯的代謝通路。

3 結(jié)果

3.1組織病理診斷結(jié)果 大鼠肝臟組織病理診斷結(jié)果見圖1。由圖1可知，正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列成索狀，肝細(xì)胞胞漿紅染，細(xì)胞核多位于中央，肝血竇見少量紅細(xì)胞，門管區(qū)小葉間動靜脈及結(jié)構(gòu)完整；肝癌組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，肝細(xì)胞排列呈巢狀，血管多，部分區(qū)域見癌性壞死，癌細(xì)胞有明顯異型性，大小不一。

圖1 大鼠肝臟病理切片圖

A.肝癌模型組；B.正常對照組。

Fig.1 Liver pathological sections of rats

A.hepatocellular carcinoma model group；B.normal control group.

3.2大鼠體質(zhì)量變化 見圖2。由圖2可知，隨著模型建立時間的延長，2組大鼠體質(zhì)量差距逐步擴(kuò)大，肝癌組大鼠體質(zhì)量明顯低于正常對照組(P<0.01)。

圖2 大鼠體質(zhì)量變化趨勢圖

Fig.2 The trend of body weight change in rats

3.3肝臟指數(shù)變化 正常對照組與肝癌模型組大鼠肝臟質(zhì)量與肝臟指數(shù)變化見表1。由表1可知，與正常對照組大鼠比較，肝癌模型組大鼠的肝臟質(zhì)量與肝臟指數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

表1 大鼠肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)

Tab.1 Liver weight and liver index in rats

組別n肝臟質(zhì)量均值/g 肝臟指數(shù)/mg·g-1正常對照組1011.76±1.14 25.36±2.75肝癌模型組924.48±5.82# 61.34±2.62#

注：與正常對照組比較#P<0.01。

3.4尿液核磁共振檢測的各項代謝物變化 核磁共振氫譜見圖3。由圖3A可知，采用OPLS-DA分析后，正常對照組與肝癌模型組大鼠實驗參數(shù)分別為R2=0.394，Q2=0.831，說明OPLS-DA分析模型得到了較好的分離，2組間差異明顯。由圖3B可知，外部驗證分析參數(shù)分別為R2=(0.0，0.683)，Q2=(0.0，-0.221)，表明正常對照組和肝癌模型組代謝成分有明顯差異，顯示PLS模式分析有效，具有預(yù)測能力。根據(jù)1H-NMR譜顯示，與正常對照組比較，肝癌模型組大鼠尿液代謝物的含量變化較明顯，肝癌模型組中含量明顯減少的尿液代謝物有異亮氨酸、乳酸、丙氨酸、醋酸鹽、糖蛋白、丙酮酸鹽、琥珀酸鹽、α-酮戊二酸、苯丙酸鹽和甲酸鹽10種，而含量明顯升高的代謝物有檸檬酸、二甲基亞硝酸、肌酸、?；撬岷图∷狒?種，見圖4和表2。對含量變化明顯的代謝物參與的代謝通路運(yùn)用MetaboAnalyst 3.0進(jìn)行分析，得出共有4種代謝通路發(fā)生了明顯變化，見表3。

圖3 大鼠尿液OPLS-DA分析的得分圖與排列驗證實驗結(jié)果

A.尿液核磁共振氫譜的OPLS-DA分析的得分圖；B.排列驗證實驗結(jié)果：R2=(0.0，0.683)，Q2=(0.0，-0.221)。

Fig.3 The score plot and arrangement test results analysis of rat urine OPLS-DA

A.score plot of OPLS-DA analysis of urine nuclear magnetic resonance spectroscopy；B.arrangement verification test results，R2=(0.0，0.683)，Q2=(0.0，-0.221).

圖4 尿液核磁共振氫譜圖

a.肝癌模型組，b正常對照組；1.異亮氨酸；2.乳酸；3.丙氨酸；4.醋酸鹽；5.糖蛋白；6.丙酮酸鹽；7.琥珀酸鹽；8.檸檬酸；9.二甲基亞硝酸；10.α-酮戊二酸；11.肌酸；12.牛磺酸；13.肌酸酐；14.苯丙氨酸；15.甲酸鹽。

Fig.4 Urine nuclear magnetic resonance spectroscopy

a.hepatocellular carcinoma model group；b.normal control group；1.isoleucine；2.lactic acid；3.alanine；4.acetate；5.glycoprotein；6.pyruvate；7.succinate；8.citric acid；9.dimethyl-nitrosamine；10.α-ketoglutaric acid；11.creatine；12.taurine；13.creatinine；14.phenylalanine；15.formate.

表2 尿液中差異性代謝物及其VIP值

Tab.2 The difference of metabolites in the urine and their VIP value

代謝物化學(xué)位移歸屬VIP值異亮氨酸0.92(t)δ-CH32.277乳酸1.32(d),4.11(q)CH3,CH4.228丙氨酸1.47(d)CH3,CH1.597醋酸鹽1.91(s)CH37.955糖蛋白2.03(s)CH31.448丙酮酸鹽2.22(s)CH31.448琥珀酸鹽2.40(s)CH22.724檸檬酸2.53(d)CH2,CH26.985二甲基亞硝酸2.71(s)CH33.009α-酮戊二酸3.02(t)12.666肌酸3.03(s)CH36.945牛磺酸3.25(t),3.41(t)CH2SO35.253肌酸酐4.05(s)CH21.598苯丙氨酸 7.37(m)H41.583甲酸鹽8.45(s)CH1.326

注：s為單峰，d為雙重峰，t為三重峰，q為四重峰，m為多重峰。

表3 差異性代謝通路分析

Tab.3 Different metabolic pathways analysis

差異性代謝通路影響因子P丁酸代謝0.041 070.001 014檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))0.147 210.001 014乙醛酸和二羧酸代謝通路0.407 410.011 763苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成0.500 000.042 158

4 結(jié)論

代謝組學(xué)通過分析體內(nèi)小分子代謝物的變化，尋找與疾病相關(guān)的潛在鑒別標(biāo)志物，由此在臨床疾病診斷中有突出的優(yōu)勢，可提供早期診斷依據(jù)[12]。本研究使用DEN造模，采集大鼠尿液，并對其進(jìn)行檢測與分析。研究結(jié)果證明，肝癌導(dǎo)致大鼠尿液代謝物成分變化明顯，會引起代謝通路的改變。

研究結(jié)果表明，與丁酸代謝通路相關(guān)的代謝物有丙酮酸鹽和琥珀酸鹽，二者在肝癌大鼠動物模型中的含量明顯降低。琥珀酸半醛和丙氨酸是γ-氨基丁酸(GABA)在γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶(GABA-T)的催化下與丙酮酸反應(yīng)生成，而GABA主要是由Glu在α-位上的脫羧反應(yīng)合成。琥珀酸半醛脫氫酶(Succinate semlalehyde dehydro-genase，SSADH) 氧化 SSA 形成琥珀酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)[13]。還原型輔酶Ⅰ(NADH)對以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)為輔助因子的SSADH活性有抑制作用，SSADH 酶活性高低與NADH的濃度相關(guān)。琥珀酸半醛能被SSADH可逆性地催化形成琥珀酸，然而在GABA代謝旁路中關(guān)鍵的酶是SSADH。肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中體內(nèi)能量的變化可能是由SSADH的活性變化所致[14]。

檸檬酸循環(huán)(TCA)是許多重要物質(zhì)生物合成的前提，也是多種能量代謝聯(lián)系的樞紐，更是三大營養(yǎng)素的最終代謝通路。檸檬酸脫氫酶(ICDHm)活性影響TCA循環(huán)中還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的生成，同時NADPH所提供的質(zhì)子數(shù)量也能影響活性氧自由基(ROS)在體內(nèi)的代謝，因此ROS的清除能力受ICDHm在TCA循環(huán)中的活性的影響。NADH與還原型黃素二核苷酸(FADH2)共同作用促使二磷酸腺苷(ADP)和Pi反應(yīng)合成腺苷三磷酸(ATP)，產(chǎn)生ROS。TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物(如草酰乙酸和α-酮戊二酸)是氨基酸和脂肪的原料。在TCA循環(huán)中，通過產(chǎn)物的反饋抑制實現(xiàn)檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶的調(diào)節(jié)。肝臟細(xì)胞中的線粒體在合成ATP的同時會生成ROS，其含量共同調(diào)節(jié)著機(jī)體的細(xì)胞凋亡和基因表達(dá)等生理生化活動，二者在機(jī)體內(nèi)處于動態(tài)平衡[15-16]。2個單位的乙酰輔酶A經(jīng)過乙酰循環(huán)生成1分子的琥珀酸是乙醛酸循環(huán)總體反應(yīng)的最主要途徑，新合成的琥珀酸從乙酰酸體轉(zhuǎn)移到線粒體，并在線粒體中轉(zhuǎn)變?yōu)樘O果酸，草酰乙酸在檸檬酸合酶的作用下生成檸檬酸[17]。二羧酸是脂肪酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵步驟，是乙酰輔酶A生物合成的關(guān)鍵通道，限速酶是異檸檬酸裂解酶和蘋果酸合成酶。

研究結(jié)果表明，二羧酸通路中的甲酸鹽在肝癌模型組大鼠尿液中的含量明顯降低，進(jìn)一步證明其與肝癌模型組大鼠體內(nèi)能量的消耗有關(guān)。但肝癌模型組大鼠尿液中檸檬酸的含量增多，TCA循環(huán)中NAD+將α-酮戊二酸氧化并釋放ATP變成琥珀酸，在檸檬酸和α-酮戊二酸的進(jìn)一步氧化過程中起到關(guān)鍵作用的是NAD+/NADH的活性。NAD+/NADH的濃度直接影響細(xì)胞的衰老、癌變和死亡等生命過程[18-20]。

在肝臟中有大部分氨基酸分解代謝。甘氨酸、絲氨酸、半胱氨酸和蘇氨酸等生物合成或降解的主要通道是甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝通路[21]。苯丙氨酸在醫(yī)學(xué)、營養(yǎng)學(xué)等領(lǐng)域均有應(yīng)用，是人體必需的氨基酸[22]。為了達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的目的，需要苯丙氨酸解氨酸(PAL)催化L-苯丙氨酸(L-phenylalanine)生成反式苯丙烯酸，從而降解腫瘤細(xì)胞所需的特異性代謝前體[23]。實驗結(jié)果表明，肝癌模型組大鼠模型中苯丙氨酸含量明顯降低，考慮可能與HCC的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)。

有學(xué)者利用核磁共振對肝硬化與肝癌患者的血清進(jìn)行了代謝組學(xué)研究。結(jié)果顯示，與健康人相比，肝硬化與肝癌患者血清中醋酸鹽、丙酮酸鹽、谷氨酰胺、甘油、酪氨酸、異亮氨酸、乙酰乙酸和肌酸等含量有顯著變化，實驗結(jié)果顯示，在肝癌模型組大鼠尿液中醋酸鹽、丙酮酸鹽和異亮氨酸代謝物的含量明顯降低，肌酸的含量增加。

腫瘤細(xì)胞代謝極其旺盛，癌癥的發(fā)展時刻伴隨著體內(nèi)代謝物的變化，因此本實驗運(yùn)用代謝組學(xué)方法，使用化學(xué)致癌劑DEN誘導(dǎo)建立肝癌大鼠模型，通過肝癌模型組大鼠尿液代謝物含量的變化得出大鼠體內(nèi)有4種代謝通路發(fā)生了明顯變化。本實驗結(jié)果可為肝癌的基礎(chǔ)研究和早期診斷提供參考依據(jù)。