張欣鈺，郭文博，王 輝，吳高榮，薛南南，陳 萌，房 康，李國(guó)梁，王鵬龍，雷海民

(北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102)

腦缺血是由于大腦供血供氧不足所致的腦部缺血性壞死類疾病[1-3]。川芎-丹參作為臨床治療缺血性腦損傷的常用配伍單元，療效確切[4-6]。本課題組前期基于“中藥配伍-化藥拼合”原理[7]，以川芎-丹參藥對(duì)功效成分為拼合前體，設(shè)計(jì)、合成了系列結(jié)構(gòu)新穎的川芎嗪-酚酸類衍生物，均顯示一定的神經(jīng)保護(hù)活性，其中先導(dǎo)化合物T-CA (3，5，6-trimethylpyrazin-2-yl)methyl(E)-3-(4-((3，5，6-trimethylpyrazin-2-l)methoxy)phenyl)acrylate)對(duì)CoCl2誘導(dǎo)損傷的PC12細(xì)胞模型具有良好的保護(hù)作用(EC50=3.68 μmol·L-1，顯著優(yōu)于川芎嗪EC50=64.46 μmol·L-1)，并可有效抑制細(xì)胞凋亡[8-15]。本研究通過Giemsa染色、DAPI熒光染色、AO及AO/EB染色等方法[16]進(jìn)一步觀察并確認(rèn)T-CA對(duì)PC12細(xì)胞損傷模型的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)改善作用。

1 儀器與材料

1.1儀器 SPECTRO star nano酶標(biāo)儀(德國(guó)BMG公司)；EC LIPSE Ti熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher公司)。

1.2試藥 化合物T-CA(本課題組前期合成)，溶解于二甲基亞砜(DMSO)；RPMI-1640培養(yǎng)基、質(zhì)量濃度為2.5 g·L-1的胰蛋白酶-EDTA溶液、青鏈霉素雙抗溶液、磷酸鹽緩沖液(PBS)(北京拜爾迪生物科技有限公司)；胎牛血清、馬血清、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)(美國(guó)Thermo Fisher公司)；無水氯化鈷、二甲基亞砜、Giemsa染料、DAPI染料、AO試劑盒、AO/EB試劑盒、HE染料(北京百諾威生物科技有限公司)。

1.3動(dòng)物 健康SD雄性大鼠(體質(zhì)量為280～300 g)(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)。

1.4細(xì)胞株 PC12細(xì)胞，購(gòu)于北京協(xié)和細(xì)胞資源中心，使用含有體積分?jǐn)?shù)為5%的胎牛血清及體積分?jǐn)?shù)為10%馬血清的RPMI-1640培養(yǎng)基置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及處理 將細(xì)胞分為4組：分化組、未分化組、損傷組和給藥組。取PC12細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基(體積分?jǐn)?shù)為1%雙抗+體積分?jǐn)?shù)為5%胎牛血清+體積分?jǐn)?shù)為10%馬血清)，培養(yǎng)于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期(狀態(tài)良好)時(shí)，應(yīng)用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基饑餓12 h，收集細(xì)胞。分化組、損傷組及給藥組用RPMI-1640培養(yǎng)基(體積分?jǐn)?shù)為1%雙抗+體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清)制得混懸細(xì)胞液，置于多聚賴氨酸包被的12孔板內(nèi)(每孔1 200 μL)，加入NGF誘導(dǎo)分化。未分化組使用含馬血清的培養(yǎng)基，且不加入NGF以抑制其分化。4組均培養(yǎng)48 h后，給藥組加入T-CA (60 μmol·L-1)預(yù)保護(hù)，其余3組加入等體積的培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h，損傷組及給藥組加入CoCl2(300 μmol·L-1)損傷PC12細(xì)胞。造模12 h后，進(jìn)行染色實(shí)驗(yàn)。

2.2Giemsa染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化 吸去12孔板中的上層細(xì)胞液，用PBS緩沖液清洗2～3次，加入冷乙醇固定細(xì)胞10 min。待細(xì)胞固定完全后，吸去多余固定液，使用PBS緩沖液清洗2～3次并加入適量Giemsa染液，染色5～10 min。吸去Giemsa染液，用PBS緩沖液清洗2～3次，置于100倍熒光倒置顯微鏡下觀察。

2.3DAPI染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化 吸去上層細(xì)胞液，用PBS緩沖液清洗，加入低溫質(zhì)量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛溶液固定細(xì)胞10 min。待細(xì)胞固定完全后，吸去多余固定液，使用PBS緩沖液清洗2～3次并加入適量DAPI染液，避光染色5～10 min。吸去DAPI染液，用PBS緩沖液清洗2～3次，置于100倍熒光倒置顯微鏡下觀察，激發(fā)光為藍(lán)光。

2.4AO染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化 吸去上層細(xì)胞液，用PBS緩沖液沖洗，加入PBS緩沖液1 mL后立刻加入質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的AO染液，避光染色1 min。置于100倍熒光倒置顯微鏡下觀察，激發(fā)光為綠光。

2.5AO/EB染色觀察細(xì)胞形態(tài)變化 吸去上層細(xì)胞液，用PBS緩沖液清洗，加入PBS緩沖液1 mL，依次加入質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的AO染液及EB染液。避光染色1 min，置于100倍熒光倒置顯微鏡下觀察，激發(fā)光為藍(lán)光。

2.6制備MCAO模型 參考文獻(xiàn)方法[17-18]：用體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛腹腔注射麻醉健康SD大鼠，用體積分?jǐn)?shù)為75%的酒精消毒后于頸部正中切口分離頸部動(dòng)脈，結(jié)扎頸總動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈。于頸內(nèi)處用動(dòng)脈夾夾閉，頸外動(dòng)脈近心端及遠(yuǎn)心端結(jié)扎。作一切口于頸總動(dòng)脈分叉處并松開動(dòng)脈夾，于切口處插入光滑尼龍線。插入深度為18±0.5 mm時(shí)停止，留1 cm固定。假手術(shù)組僅暴露及分離，不進(jìn)行結(jié)扎。參考Zea Longa評(píng)分法，于術(shù)后3 d進(jìn)行評(píng)分：0分為無明顯神經(jīng)癥狀表現(xiàn)；1分為左側(cè)前爪不能完全伸展；2分為大鼠出現(xiàn)向左側(cè)旋轉(zhuǎn)癥狀；3分為大鼠行走時(shí)出現(xiàn)向左側(cè)傾倒現(xiàn)象；4分為癲癇及昏迷不能自行行走。評(píng)分1～3分的大鼠入選實(shí)驗(yàn)。

2.7分組與給藥 實(shí)驗(yàn)包括假手術(shù)組、模型組及給藥組。將評(píng)分為1～3分的大鼠隨機(jī)分組至模型組及給藥組，分組結(jié)果為假手術(shù)組3只，模型組5只，給藥組4只。給藥組灌胃給藥T-CA (10 mL·kg-1) 10 d，其余2組給予等量羧甲基纖維素鈉溶液。

2.8取材 用體積分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛麻醉后心臟取血，生理鹽水灌注，肝臟逐漸呈白色后改用質(zhì)量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛溶液灌注。大鼠僵硬后取大鼠腦組織并存于質(zhì)量濃度為40 g·L-1的多聚甲醛溶液中。腦組織海馬區(qū)切片后進(jìn)行HE染色。

3 結(jié)果

3.1Giemsa染色觀察T-CA對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 鏡下觀察可見，未分化組PC12細(xì)胞狀態(tài)正常，細(xì)胞核形態(tài)完整、著色均勻、細(xì)胞有聚團(tuán)現(xiàn)象，見圖1。NGF誘導(dǎo)分化組細(xì)胞邊緣出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞突觸，突觸連接處有類似神經(jīng)節(jié)的節(jié)點(diǎn)。損傷組細(xì)胞神經(jīng)突觸出現(xiàn)變短或消失的情況，細(xì)胞核染色不均勻且細(xì)胞數(shù)量顯著減少。給藥組進(jìn)行預(yù)保護(hù)后，細(xì)胞核染色較均勻，神經(jīng)突觸部分保留較好且細(xì)胞數(shù)量無明顯減少，見圖1。

3.2DAPI染色觀察T-CA對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 鏡下觀察可見，未分化組與分化組細(xì)胞核呈均勻藍(lán)色狀態(tài)。損傷組細(xì)胞數(shù)量顯著減少，核著色高度凝聚。給藥組進(jìn)行預(yù)保護(hù)后，細(xì)胞核染色較為均勻且細(xì)胞數(shù)量無明顯減少，見圖1。

3.3AO染色觀察T-CA對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 鏡下觀察可見，丫啶橙染色綠色光激發(fā)后未分化組與分化組細(xì)胞核顯均勻黃綠色熒光。損傷組因細(xì)胞凋亡，黃綠色熒光聚集于核膜的內(nèi)側(cè)，細(xì)胞膜泡狀膨出。給藥組進(jìn)行預(yù)保護(hù)后，細(xì)胞膜泡狀膨出情況明顯改善，見圖1。

圖1 T-CA對(duì)CoCl2損傷PC12細(xì)胞形態(tài)的影響

Ⅰ.Giemsa染色；Ⅱ.DAPI染色；Ⅲ.AO染色；Ⅳ.AO/EB染色；A.未分化PC12細(xì)胞；B.分化PC12細(xì)胞；C.CoCl2損傷PC12細(xì)胞；D.T-CA保護(hù)CoCl2損傷PC12細(xì)胞。

Fig.1 Effect of T-CA on PC12 cells insulted by CoCl2on morphology determined by Giemsa, DAPI, AO and AO/EB staining

Ⅰ.Giemsa staining；Ⅱ.DAPI staining；Ⅲ.AO staining；Ⅳ.AO/EB staining；A.undifferentiated PC12 cells；B.differentiated PC12 cells；C.CoCl2-insulted PC12 cells；D.CoCl2-insulted PC12 cells with T-CA.

3.4AO/EB染色觀察T-CA對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 鏡下觀察可見，丫啶橙(AO)染料可進(jìn)入未分化組及分化組正常細(xì)胞膜中呈黃綠色熒光。溴乙錠(EB)染料則進(jìn)入受損細(xì)胞膜顯橘紅色熒光。損傷組細(xì)胞凋亡，細(xì)胞數(shù)量顯著減少，呈橘紅色染色狀態(tài)。給藥組進(jìn)行預(yù)保護(hù)后，因改善細(xì)胞凋亡情況，多見黃綠色染色，見圖1。

3.5T-CA給藥對(duì)MCAO大鼠存活情況的影響 通過比較3組大鼠的存活情況，發(fā)現(xiàn)T-CA給藥組及假手術(shù)組大鼠無死亡情況，模型組2只大鼠死亡。可初步證明化合物T-CA可有效延長(zhǎng)MCAO模型大鼠的生存時(shí)間，見表1。

3.6T-CA給藥對(duì)MCAO大鼠腦皮層神經(jīng)細(xì)胞的影響 鏡下觀察MCAO大鼠腦組織海馬區(qū)HE染色切片，分析T-CA對(duì)模型大鼠皮層神經(jīng)細(xì)胞的影響。假手術(shù)組(Sham)大腦皮層未見明顯的病理變化，其神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞核仁清晰，細(xì)胞質(zhì)呈均勻染色；模型組(Model)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞大量壞死，細(xì)胞核輪廓模糊，胞漿溶解，部分微血管有栓塞情況；給藥組(T-CA)與模型組對(duì)比，組織壞死面積相對(duì)減少且程度較輕，細(xì)胞空泡范圍減少，形態(tài)較為完整，見圖2。

表1 給藥10 d后MCAO大鼠的存活情況

Tab.1 The survival rate of MCAO rats after T-CA administration for 10 d

組別總數(shù)/只存活數(shù)/只存活率/%假手術(shù)組44100模型組5360給藥組44100

圖2 MCAO大鼠腦組織海馬區(qū)HE染色

A.假手術(shù)組(×100);B.假手術(shù)組(×200);C.模型組(×100);D.模型組(×200);E.給藥組(×100);F.給藥組(×200)。

Fig.2 HE staining in the hippocampus of MCAO mice brain sections

A.sham group(×100)；B.sham group(×200);C.model group(×100);D.model group(×200);E.T-CA group(×100);F.T-CA group(×200).

4 討論

缺血性腦卒中是一類常見的心腦血管類疾病，中醫(yī)認(rèn)為其屬于中風(fēng)范疇，其發(fā)病機(jī)制是血脈瘀阻腦絡(luò)所致，臨床一般采用活血化瘀理氣藥治療[19-20]。川芎具有良好的活血行氣和祛風(fēng)止痛的功能，常與丹參配伍使用治療此類疾病，其主要化學(xué)成分川芎嗪也被證明能夠有效減少腦缺血再灌注所造成的腦部神經(jīng)損傷[21-22]。基于中藥配伍與化學(xué)藥物拼合原理，選取川芎嗪與香豆酸進(jìn)行結(jié)構(gòu)拼合得到新型川芎嗪-香豆酸衍生物T-CA，并探討其對(duì)腦缺血損傷模型的保護(hù)作用。

PC12細(xì)胞模型是一種常用的神經(jīng)細(xì)胞株，經(jīng)NGF誘導(dǎo)后分化呈神經(jīng)元樣，有顯著的細(xì)胞突觸，可廣泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。本實(shí)驗(yàn)使用CoCl2造模PC12細(xì)胞使形成擬腦缺血損傷的細(xì)胞模型，并評(píng)價(jià)化合物T-CA對(duì)其形態(tài)的保護(hù)作用。MCAO大鼠模型是常用的大腦中動(dòng)脈缺血評(píng)價(jià)模型。本實(shí)驗(yàn)采取Zea Longa法制備MCAO模型并評(píng)價(jià)化合物T-CA對(duì)大鼠存活率的改善情況。

實(shí)驗(yàn)通過Giemsa、DAPI、AO和AO/EB 4種細(xì)胞染色方法，驗(yàn)證了T-CA對(duì)CoCl2造模損傷的PC12細(xì)胞具有顯著的保護(hù)作用，能夠有效緩解損傷細(xì)胞的形態(tài)變化。同時(shí)，根據(jù)AO/EB染色結(jié)果可推斷新型川芎嗪-香豆酸衍生物T-CA可能是通過抑制PC12細(xì)胞凋亡而發(fā)揮作用，這也為后續(xù)的研究機(jī)制提供了方向。在MCAO模型實(shí)驗(yàn)中，T-CA給藥組大鼠的存活率顯著高于模型組，并通過大鼠腦組織海馬區(qū)HE染色檢測(cè)缺血缺氧腦組織的神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)特征。與模型組相比，給藥組神經(jīng)細(xì)胞壞死區(qū)域顯著減少，正常形態(tài)神經(jīng)元較多，胞漿溶解較少，能有效緩解腦缺血造成的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。但大鼠樣本量較少，在后續(xù)的研究中需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，新型川芎嗪-香豆酸衍生物T-CA能顯著改善CoCl2損傷PC12細(xì)胞所導(dǎo)致的形態(tài)改變，保持神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)完整性。同時(shí)，可提高M(jìn)CAO模型大鼠的存活率并有效緩解大鼠腦組織海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡及壞死，保護(hù)了損傷神經(jīng)細(xì)胞的功能，為此類化合物的后續(xù)研究提供了參考依據(jù)。