● 楊美玲 周雪玲 彭美中 盧 妍 彭 軍,3,4 陳友琴 Thomas Joseph SFERRA,5 褚劍鋒,3,4▲

高血壓是引起腎臟損害和終末期腎病的重要危險(xiǎn)因素，其中過度激活的腎素血管緊張素系統(tǒng)是引起高血壓及高血壓腎臟損傷的重要發(fā)病機(jī)制之一[1]?，F(xiàn)有的藥物治療措施還不能完全逆轉(zhuǎn)高血壓腎損害至終末期腎衰的進(jìn)程，大量的基礎(chǔ)與臨床研究證實(shí)，中醫(yī)藥對(duì)高血壓腎損害的治療表現(xiàn)出了一定的潛力，但其相應(yīng)作用機(jī)制尚不清楚。清達(dá)顆粒是陳可冀院士由其幾十年的臨床經(jīng)驗(yàn)方清眩降壓湯化裁而來的，主要藥物組成有天麻、鉤藤、黃芩、蓮子心，具有清肝熱、平肝陽等功效，主治高血壓病。本文采用血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)誘發(fā)的高血壓小鼠為研究對(duì)象，觀察在高血壓腎損害進(jìn)程中清達(dá)顆粒對(duì)血壓、腎臟病理形態(tài)的影響，探討該方對(duì)高血壓腎臟的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡雄性C57BL/6小鼠18只，SPF級(jí)，體重20～25g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：2018093)，在福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器AngⅡ(Sigma，RN474-91-3，A9525-10mg)；植入式膠囊滲透壓泵(ALZET)；小鼠無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)(肯特動(dòng)物無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)，kent)；糖原PAS染色液試劑盒(Abcam)；Masson三色染色試劑盒(Abcam)；清達(dá)顆粒(由天江藥業(yè)有限公司制備，批號(hào)1805351)；HE染色液(索萊寶，G1120)。

1.3動(dòng)物模型構(gòu)建雄性C57BL/6小鼠18只適應(yīng)環(huán)境一周后常規(guī)飼養(yǎng)，用5%水合氯醛(7ml/kg)麻醉，依據(jù)體重編號(hào)，并由此采用數(shù)字表法，隨機(jī)分為3組：(1)對(duì)照組(n=6)：剔除肩胛背部的鼠毛，作一假切口并縫合，作為對(duì)照；(2)模型組(n=6)：植入灌有AngⅡ膠囊滲透壓泵，該泵可連續(xù)28d釋放AngⅡ到周圍組織(500ng/kg/min)，最后將其縫合。(3)給藥組(n=6)：植入AngⅡ滲透壓泵并灌胃給藥治療28d。給藥組于手術(shù)后第一天開始予清達(dá)顆粒(生理鹽水溶解，制作母液備用)灌胃給藥，根據(jù)人一日一劑換算，鼠每次劑量為22.9mg/天/0.2mL，模型組和對(duì)照組灌以同等體積的生理鹽水，每天1次，連續(xù)給藥28d。

1.4血壓測量分別測量手術(shù)前、手術(shù)第1、3、5、7、14、21天及手術(shù)第28天的收縮壓和舒張壓。

1.5腎臟病理檢測新鮮小鼠腎臟組織去除包膜后，沿橫截面將腎臟切開，取1/2腎臟組織經(jīng)4%多聚甲醛固定24H后，包埋、制作石蠟切片。采用HE、PAS、Masson染色觀察腎臟損傷、膠原沉積及炎癥細(xì)胞在腎臟的浸潤情況。HE、PAS和Masson法的染色程序參照試劑盒說明書。

1.6腎小球硬化程度評(píng)分[2]每張切片觀察取6個(gè)視野，評(píng)分腎小球損傷程度。分為0分：正常腎小球、無硬化；1分：輕度損傷，腎小球損傷比例<25%；2分：中度損傷，腎小球損傷比例25%～75%；4分：完全損傷，腎小球損傷比例>75%。纖維化測量方法：每張切片取6個(gè)視野，采用IPP軟件計(jì)算藍(lán)色纖維化面積占總面積的百分比。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS18.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料若符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，若不符合則以中位數(shù)和四分位數(shù)間距(M，Q)表示，采用非參數(shù)分析(秩和檢驗(yàn)等)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1清達(dá)顆粒對(duì)血壓的影響給藥前，三組的血壓差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；給藥后，模型組的血壓從第1天開始就逐漸升高，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；給藥組的血壓(收縮壓從第7天開始到第28天、舒張壓從第21天到第28天)與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，清達(dá)顆粒干預(yù)顯著抑制了血壓的升高幅度。見表1、表2。

表1 清達(dá)顆粒連續(xù)給藥后各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)收縮壓變化

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

表2 清達(dá)顆粒連續(xù)給藥后各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)舒張壓變化

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05

2.2清達(dá)顆粒對(duì)小鼠腎臟病理特征和硬化積分的影響如圖1所示，對(duì)照組可見腎小球形態(tài)正常無固縮，腎小囊未增大，腎小囊壁未見增厚，近、遠(yuǎn)曲小管結(jié)構(gòu)正常，未見蛋白管型；模型組可見大多數(shù)腎小球嚴(yán)重固縮，灌注不足，腎小囊增大，球囊粘連，腎小囊壁增厚(→所示)；而清達(dá)顆粒組腎小球結(jié)構(gòu)形態(tài)相比模型組大有改善，腎小球固縮減輕，腎小囊減小。進(jìn)一步評(píng)估腎小球硬化程度，采用積分評(píng)估，如圖2所示，與對(duì)照組對(duì)比，模型組腎小球硬化積分顯著增高(P<0.05)，清達(dá)顆粒給藥后腎小球硬化積分較模型組顯著降低(P<0.05)。PAS染色顯示(圖3)，模型組腎小球固縮，基底膜增厚、腎小管萎縮、腎小囊增寬(→所示)，清達(dá)顆粒干預(yù)顯著改善上述病理特征。

圖1 清達(dá)顆粒對(duì)AngⅡ引起的腎臟損害的一般病理影響(HE染色，×400)

圖2 清達(dá)顆粒對(duì)各組腎小球硬化程度積分的影響

圖3 清達(dá)顆粒對(duì)AngⅡ引起的腎小球基底膜的影響(PAS染色，×400)

2.3清達(dá)顆粒對(duì)腎臟纖維化的影響如圖4所示，與對(duì)照組對(duì)比模型組腎小球和腎間質(zhì)藍(lán)染明顯(→所示)，清達(dá)顆粒干預(yù)后，藍(lán)染的膠原纖維明顯減少。如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組腎小囊及腎間質(zhì)膠原陽性表達(dá)明顯(P<0.05)，給藥組腎小囊及腎間質(zhì)纖維性物質(zhì)較模型組明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 清達(dá)顆粒對(duì)AngⅡ引起的腎臟纖維化的影響(Masson染色，×400)

圖5 清達(dá)顆粒對(duì)各組腎臟膠原陽性區(qū)域比率的影響

3 討論

高血壓是最常見的慢性疾病之一，在《中國高血壓防治指南2018修訂版》中，將高血壓的診斷標(biāo)準(zhǔn)定為：在未使用降壓藥物的情況下，診室收縮壓≥140mm Hg和(或)舒張壓≥90mm Hg；根據(jù)血壓水平分為正常、正常高值血壓和1、2、3級(jí)高血壓；同時(shí)，還根據(jù)血壓水平、心血管危險(xiǎn)因素、靶器官損害、臨床并發(fā)癥和糖尿病進(jìn)行心血管危險(xiǎn)分層，分為低危、中危、高危和很高危4個(gè)層次。3級(jí)高血壓伴1項(xiàng)及1項(xiàng)以上危險(xiǎn)因素，合并靶器官損害、CKD3期以上、糖尿病等均屬于心血管風(fēng)險(xiǎn)很高?；颊遊3]?？梢?，高血壓具有高發(fā)病率及致死率，可累及多處靶器官。其中，腎臟損傷是高血壓很常見的并發(fā)癥之一。美國最新腎臟疾病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，高血壓是導(dǎo)致終末期腎病的第2位病因[4-5]。

AngⅡ是血管緊張素中最重要的組成部分，具有收縮血管、促進(jìn)醛固酮分泌、參與渴覺反應(yīng)、影響心輸出量、增加血管通透性等生理功能。其中收縮血管和促進(jìn)醛固酮分泌是最為重要的[6]。研究證明，Ang Ⅱ通過作用于球狀帶上的AI受體(受體存在于細(xì)胞膜上)，二者結(jié)合以后誘導(dǎo)生成一種酶蛋白，后者便以某種方式促使膽固醇轉(zhuǎn)變成孕烯醇酮，然后孕烯醇酮再經(jīng)多次轉(zhuǎn)變，最后生成醛固酮。當(dāng)醛固酮分泌過多時(shí)將引起鈉水潴留進(jìn)而血壓升高[7]。因此，AngⅡ不僅能影響小動(dòng)脈的緊張度，而且還能影響血容量，這兩種因素的相互作用，在很大程度上，決定了血壓的高低。腎臟器官的細(xì)胞上存在有血管緊張素受體，有研究表明，高血壓腎損害的發(fā)病機(jī)制與交感神經(jīng)系統(tǒng)(SNS)活性升高、腎素-血管緊張素系統(tǒng)異常、鹽負(fù)荷、遺傳或先天因素、高血壓狀態(tài)下腎小球前小動(dòng)脈阻力增加及腎小球內(nèi)高壓有關(guān)[4]。

清達(dá)顆粒是陳可冀院士由其60余年臨床經(jīng)驗(yàn)方清眩降壓湯[8]化裁而來，主要用于治療高血壓病患者。其中天麻、鉤藤平肝潛陽熄風(fēng)，輔以蓮子心、黃芩清熱滋陰，共奏平肝陽、清肝熱之功。本研究發(fā)現(xiàn)該方可以降低AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓小鼠的收縮壓、舒張壓。與模型組對(duì)比，該方較好地抑制了由高血壓導(dǎo)致的腎小球硬化固縮、腎小管增生、蛋白管型形成，改善腎臟纖維化等。其機(jī)制可能與抑制循環(huán)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性，控制血壓的升高有關(guān)。

中藥組方的整體調(diào)節(jié)特征與辨證觀念是從多靶點(diǎn)、多層次的整體較為綜合的層面發(fā)揮藥理學(xué)作用，從而達(dá)到防病治病的目的。清達(dá)顆粒可能是通過有效中藥成分調(diào)控RAAS的平衡，以此發(fā)揮降壓作用，改善臨床癥狀，促進(jìn)腎損害等病理改變的恢復(fù)，不僅起到了降低血壓的作用，還從整體上保護(hù)靶器官的損害。綜上所述，清達(dá)顆粒能夠抑制AngⅡ誘導(dǎo)的血壓升高幅度，減輕由于高血壓導(dǎo)致的腎損害。本次研究沒有對(duì)藥物劑量梯度進(jìn)行評(píng)價(jià)，是否增加劑量能夠進(jìn)一步提高療效，相關(guān)藥效機(jī)制是什么，與交感神經(jīng)系統(tǒng)活化、整個(gè)RAAS有關(guān)與否，是否與血管內(nèi)皮功能保護(hù)有關(guān)等等，一系列的問題都值得進(jìn)一步研究與探索。今后相關(guān)研究工作也將沿著上述問題，以及規(guī)范的臨床療效評(píng)價(jià)來開展，也期望能夠獲得令人滿意的結(jié)果。