鄭玥 曾慶梅

摘要[目的]探討類蛋白反應(yīng)在醋蛋液水解過程中對(duì)其膽酸結(jié)合能力的影響。[方法]采用胃蛋白酶水解醋蛋液，制備水解度為43.61%，膽酸結(jié)合能力為64.01%的醋蛋液水解物，并以游離氨基減少量為試驗(yàn)指標(biāo)，利用響應(yīng)面法優(yōu)化胃蛋白酶催化的類蛋白反應(yīng)修飾條件，得到不同修飾程度的產(chǎn)物，測(cè)定其結(jié)合膽酸的能力。[結(jié)果]修飾產(chǎn)物的膽酸結(jié)合能力均提高，并且結(jié)合能力最高的修飾產(chǎn)物的結(jié)合能力達(dá)到102.1%，該修飾產(chǎn)物通過乙醇∶水（7∶3）或乙醇∶水（3∶7）比例的溶劑進(jìn)行離心分級(jí)后，上清液（沉淀）部分的膽酸結(jié)合能力高于（低于）修飾產(chǎn)物，并通過對(duì)該修飾產(chǎn)物和上清液部分、沉淀部分的進(jìn)一步酶水解處理的結(jié)果顯示，酶水解會(huì)導(dǎo)致它們的結(jié)合能力降低，但是仍然高于最初的醋蛋液水解物。[結(jié)論]類蛋白反應(yīng)可以提高醋蛋液水解物的膽酸結(jié)合能力和對(duì)蛋白酶抵抗的能力。

關(guān)鍵詞類蛋白反應(yīng);醋蛋液水解物;胃蛋白酶;溶劑萃取;蛋白酶抵抗

中圖分類號(hào)TS201.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）01-0154-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.047

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

大量科學(xué)理論證明食物蛋白水解物與膽酸結(jié)合可以阻止膽酸重吸收，從而降低內(nèi)源性膽固醇濃度[1-3]。膽酸結(jié)合能力可能與水解物和肽暴露出的疏水性氨基酸殘基有關(guān)系[4]。同時(shí)，許多研究發(fā)現(xiàn)蛋白水解物比蛋白質(zhì)本身有著更大的結(jié)合潛力[5-6]。醋蛋液是一種民間廣為流傳的飲品，它有很多藥理作用，比如免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、消化功能提升、減輕人體內(nèi)膽固醇水平、降血壓和抗氧化等作用。許多人從醋蛋液中分離出ACE抑制肽和抗氧化肽[7-8]。但是目前還沒有從醋蛋液中分離出可以結(jié)合膽酸的肽。

類蛋白反應(yīng)在食品科學(xué)領(lǐng)域是一種很重要的反應(yīng)，其反應(yīng)機(jī)制具有多樣性和爭(zhēng)議性。在同一個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)中可能含有多個(gè)反應(yīng)機(jī)制，主要包括水解、聚集、轉(zhuǎn)肽作用和物理聚集。主導(dǎo)類蛋白反應(yīng)機(jī)制是由反應(yīng)系統(tǒng)的特定條件（反應(yīng)底物、酶和其他條件）決定的。類蛋白反應(yīng)可以有效地去除蛋白水解物的苦味[9]，通過引進(jìn)許多重要的氨基酸進(jìn)入蛋白水解物的肽分子解決氨基酸組成失衡問題[10-11]。

類蛋白反應(yīng)利用某些分子的氨基酸序列改變，即新的肽分子的產(chǎn)生和氨基酸序列的重組，改善生物活性肽提高其生理活性。Qian等[12]通過測(cè)定膽酸結(jié)合能力來研究類蛋白

反應(yīng)的作用，發(fā)現(xiàn)類蛋白反應(yīng)可以提高膽酸結(jié)合能力。Howard等[13]報(bào)道蛋白水解物通過結(jié)合膽酸由膽固醇轉(zhuǎn)化為膽酸。雞肉水解物的類蛋白反應(yīng)修飾物由于肽聚集比原水解物捆綁更多的膽酸[14]。因此，利用胃蛋白酶制備醋蛋液水解物，再利用胃蛋白酶催化的類蛋白反應(yīng)對(duì)水解物進(jìn)行修飾，評(píng)價(jià)其膽酸結(jié)合能力和探究進(jìn)一步酶水解對(duì)其結(jié)合能力的影響。

1材料與方法

1.1材料與試劑

胃蛋白酶，堿性蛋白酶，胰蛋白酶，上海源葉生物科技公司;其他試劑均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備AG135電子水平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）;BSG-26電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1醋蛋液水解物的制備。

雞蛋用水洗凈后，95%酒精消毒，晾干后按照1∶3（W/V）的比例放于米醋中，浸泡48h后，雞蛋被戳破攪拌獲得混合液。最后，混合液被凍成粉，便于后續(xù)分析。醋蛋粉（5g）溶解于50mL去離子水中，用1.0mol/LHCl調(diào)節(jié)pH至2.0，加入胃蛋白酶于37℃下水解1～7h，在100℃水浴中保持10min后終止反應(yīng)。待冷卻到室溫后，5000r/min離心15min，取上清液測(cè)定其水解度和膽酸結(jié)合能力。具有最大結(jié)合能力的水解物被大量制備，凍干，用于類蛋白反應(yīng)的底物。

1.3.2醋蛋液水解物的類蛋白反應(yīng)修飾。

用胃蛋白酶對(duì)醋蛋液水解產(chǎn)物進(jìn)行類蛋白反應(yīng)修飾。采用中心組合試驗(yàn)，通過測(cè)定反應(yīng)體系的游離氨基量變化，利用響應(yīng)面法對(duì)底物質(zhì)量濃度、酶添加量、反應(yīng)溫度等3個(gè)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化（表1），以選擇適宜的修飾反應(yīng)條件。反應(yīng)結(jié)束后，修飾產(chǎn)物在沸水浴滅酶15min，冷卻后凍干，20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｔ趦?yōu)選的條件下，改變反應(yīng)時(shí)間（1，3，5，7和9h）制備5個(gè)修飾產(chǎn)物，測(cè)定游離氨基含量及其膽酸結(jié)合能力。具有最大結(jié)合能力的修飾產(chǎn)物被大量制備，凍干，以備后續(xù)的溶劑萃取和進(jìn)一步酶解。

1.3.3修飾產(chǎn)物的溶劑萃取和分離。

利用不同的介質(zhì)對(duì)最大結(jié)合能力的修飾產(chǎn)物進(jìn)行分離，10000r/min離心30min，分離出上清液和沉淀，測(cè)定其游離氨基含量和膽酸結(jié)合能力，分別凍干，用于進(jìn)一步研究。

1.3.4修飾產(chǎn)物和上清液、沉淀部分的進(jìn)一步酶解。對(duì)最大結(jié)合能力的修飾產(chǎn)物和離心分級(jí)產(chǎn)物（上清液部分和沉淀部分）分別采用胃蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶進(jìn)行酶水解處理，并對(duì)其產(chǎn)物的游離氨基含量和膽酸結(jié)合能力進(jìn)行分析測(cè)定。

1.3.5游離氨基含量、醋蛋液水解度（DH）和膽酸結(jié)合能力測(cè)定。

樣品游離氨基含量通過鄰苯二甲醛（OPA）法測(cè)定[15-16]，醋蛋液水解度通過Adler-Nissen提出的公式計(jì)算[17]，膽酸結(jié)合能力根據(jù)Kahlon和Chow提出的方法來測(cè)定[18]，使用消膽胺作為膽酸結(jié)合能力的陽性對(duì)照藥物。

2結(jié)果與分析

2.1醋蛋液水解物的制備

胃蛋白酶在人體胃環(huán)境中保持穩(wěn)定，我們希望醋蛋液類蛋白修飾產(chǎn)物穩(wěn)定存在于胃中，所以胃蛋白酶被選擇作為該研究中水解和聚集作用的催化劑[12]。醋蛋液相對(duì)于消膽胺（結(jié)合能力100%）來說具有43.21%的膽酸結(jié)合能力。由圖1可以看出，當(dāng)水解時(shí)間在0～5h，制備的醋蛋液水解物的水解度從21.24%上升到43.61%，膽酸結(jié)合能力從43.21%提高到64.01%。但是，更長(zhǎng)的水解時(shí)間不能顯著影響其結(jié)合能力。水解度為43.61%時(shí)，水解物的膽酸結(jié)合能力最大，為64.01%，因此選擇此醋蛋液水解物作為進(jìn)一步修飾反應(yīng)的底物。

Sun等[19]用堿性蛋白酶水解酪蛋白6h后得到水解度為10.9%，IC50為52.6μg/mL的水解物，Zhang等[20]用堿性蛋白酶水解大豆蛋白，獲得的大豆蛋白水解物水解度為14.0%，螯合鈣離子能力為41.0mg/g肽。Wei等[21]報(bào)道稱酪蛋白被水解4h時(shí)，水解物表現(xiàn)出最大的ACE抑制活性（42.9%）。Lin等[22]發(fā)現(xiàn)海瓜子的可食用肌肉部分在消化酶水解后有更強(qiáng)的膽酸結(jié)合能力。該研究結(jié)果與以上結(jié)論較為相近，說明在一定范圍內(nèi)，某些蛋白質(zhì)的膽酸結(jié)合能力和其水解度呈正相關(guān)。

2.2醋蛋液水解物的類蛋白反應(yīng)修飾與產(chǎn)物的膽酸結(jié)合能力通過中心組合試驗(yàn)，利用響應(yīng)面法對(duì)底物濃度、酶添加量、反應(yīng)溫度等3個(gè)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化（表1），共計(jì)20次試驗(yàn)，以選擇適宜的修飾反應(yīng)條件。采用Design-Expert8.0.6軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)條件，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸擬合，得到底物濃度（X1）、酶添加量（X2）和反應(yīng)溫度（X3）的回歸方程模型：

Y=+101.76+6.58X1+2.60X2+5.25X3-1.75X1X2-3.50X1X3-7.50X2X3-4.06X12-10.42X22-5.83X32

P<0.0001，失擬項(xiàng)P=0.0771>0.05，說明該模型失擬不顯著，方程能夠反應(yīng)游離氨基變化量與各因素之間的關(guān)系;R2=0.9536，R2Adj=0.9118，即該模型能解釋91.18%，有4.78%的變異不能用該模型解釋，說明該模型與實(shí)際擬合較好，影響因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系顯著，因此能用此模型對(duì)游離氨基變化量進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)（圖2）。A、C、BC、A2、B2、C2對(duì)應(yīng)的P值小于0.01，影響極顯著，說明這幾個(gè)因素對(duì)游離氨基變化量的影響大，由F值的大小可知，3個(gè)因素對(duì)游離氨基變化量的影響順序?yàn)榈孜餄舛?反應(yīng)溫度>酶添加量。

根據(jù)所得的模型，進(jìn)一步確定各因素最佳條件，得優(yōu)化的提取條件：底物濃度為42.07%，酶添加量為2.47kU/gpeptides，反應(yīng)溫度為32.54℃，預(yù)測(cè)的結(jié)果為104.721μmol/gpeptides。為了便于操作，將以上參數(shù)修正為：底物濃度為42.1%，酶添加量為2.5kU/gpeptides，反應(yīng)溫度為32.5℃，2組平行試驗(yàn)的結(jié)果分別為103.5和102.8μmol/gpeptides，平均值為103.15μmol/gpeptides，低于計(jì)算值104.721μmol/gpeptides（P>0.05），表明采用該模型得到的預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)真實(shí)值相符度高，得到的條件參數(shù)可靠。

利用這些反應(yīng)條件，對(duì)醋蛋液水解物進(jìn)行修飾，根據(jù)反應(yīng)時(shí)間不同（1、3、5、7和9h）制備5個(gè)不同修飾程度的修飾產(chǎn)物（產(chǎn)物1～5），它們的膽酸結(jié)合能力、游離氨基變化量列于表2，結(jié)果表明，在類蛋白反應(yīng)初始階段，游離氨基減少量增加，反應(yīng)時(shí)間5h，游離氨基減少量最大，為103.7μmol/gpeptides，游離氨基含量下降最多，這可能是因?yàn)槊附鈱?dǎo)致的游離氨基酸的共價(jià)修飾，導(dǎo)致酰胺結(jié)合和肽的聚集[12]。反應(yīng)時(shí)間超過5h后，游離氨基減少量不再增加，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，水解程度不斷增強(qiáng)[23]。這些修飾產(chǎn)物的膽酸結(jié)合能力從61.3%增加到102.1%（相對(duì)于消膽胺），均比原始的醋蛋液水解物（52.7%）要高，表明類蛋白反應(yīng)可以增強(qiáng)醋蛋液水解物的單算結(jié)合能力。因此，將反應(yīng)時(shí)間為5h的修飾產(chǎn)物，即修飾產(chǎn)物5用于進(jìn)一步的溶劑萃取和酶解。

2.3修飾產(chǎn)物的溶劑萃取

Qian等[12]報(bào)道許多水解物中的肽在類蛋白反應(yīng)期間聚集形成沉淀，疏水性肽鍵可能在反應(yīng)中發(fā)揮很大的作用。修飾產(chǎn)物5在加入不同溶劑后進(jìn)行離心分級(jí)分離，分離后分別得到上清液和沉淀2個(gè)部分。由表3可知，乙醇-水溶劑（7∶3，V/V）可以有效地分離修飾產(chǎn)物5的活性部分，獲得的上清液相比醋蛋液水解物有著較高的膽酸結(jié)合能力，而沉淀的膽酸結(jié)合能力弱于醋蛋液水解物，結(jié)果表明低極性溶劑可以豐富疏水性肽組分。相反，乙醇-水（3∶7，V/V）有較高的極性，所以低極性肽組分在沉淀部分被發(fā)現(xiàn)而展現(xiàn)出較高的結(jié)合能力。說明疏水性肽組分存在于低極性溶劑中，可能是增加膽酸結(jié)合能力的主要原因。疏水性氨基酸因?yàn)槠鋬捎H性結(jié)構(gòu)通過疏水作用結(jié)合膽酸[24]。Brownsell等[25]報(bào)道蛋白水解物在通過類蛋白修飾后，其疏水性氨基酸組成增加，從而影響其膽酸結(jié)合能力。

2.4修飾產(chǎn)物和分級(jí)產(chǎn)物進(jìn)一步酶解與膽酸結(jié)合能力的變化

由表4可知，修飾產(chǎn)物5和它的分級(jí)產(chǎn)物相對(duì)于其對(duì)應(yīng)的底物都有更高的游離氨基含量，表明它們均被3種酶進(jìn)一步的水解。但是，進(jìn)一步酶解的最終產(chǎn)物的膽酸結(jié)合能力低于修飾產(chǎn)物5（76.4%）或者分級(jí)產(chǎn)物（上清液106.4%，沉淀70.3%）?？梢?，每一個(gè)樣品的膽酸結(jié)合能力都被降低，且對(duì)胃蛋白酶、堿性蛋白酶和胰蛋白酶的水解敏感。整體來說，目前的研究表明類蛋白修飾不僅能夠提高醋蛋液水解物的膽酸結(jié)合能力，而且能夠提高其對(duì)蛋白酶的抵抗能力。在3種酶的水解之后，相比于溶劑萃取后的產(chǎn)物，修飾產(chǎn)物5具有更強(qiáng)的膽酸結(jié)合能力，表明醋蛋液修飾產(chǎn)物不能通過溶劑萃取提高其對(duì)蛋白酶抵抗的能力。

3結(jié)論

通過對(duì)胃蛋白酶水解制備的醋蛋液水解物進(jìn)行類蛋白反應(yīng)修飾，膽酸結(jié)合能力從52.7%提高到102.1%，以游離氨基含量減少量為指標(biāo)，響應(yīng)面法得到的類蛋白修飾反應(yīng)條件為：底物濃度42.1%、酶添加量2.5kU/gpeptides、反應(yīng)溫度25℃和反應(yīng)時(shí)間5h。利用體積比為7∶3的乙醇-水溶劑對(duì)修飾產(chǎn)物進(jìn)行離心分級(jí)處理，表明上清液的膽酸結(jié)合能力明顯高于修飾產(chǎn)物，但是沉淀部分則低于修飾產(chǎn)物。修飾產(chǎn)物及離心分級(jí)產(chǎn)物的進(jìn)一步酶水解處理，表明類蛋白修飾不僅能夠提高醋蛋液水解物的膽酸結(jié)合能力，而且能夠提高其對(duì)蛋白酶的抵抗能力。

參考文獻(xiàn)

[1]ALHAJOA，IRSHADI，KANEKANIANAD.HypocholesterolemicandangiotensinIconvertingenzymeinhibitingactivityoftrypsinhydrolysedbovinecasein[J].Journalofnutritionalhealth&foodengineering，2016，5（3）：177.

[2]NAGAOKAS，F(xiàn)UTAMURAY，MIWAK，etal.Identificationofnovelhypocholesterolemicpeptidesderivedfrombovinemilkbeta-lactoglobulin[J].Biochemicalandbiophysicalresearchcommunications，2001，281（1）：11-17.

[3]SHIRATAS，ODAK，ONODERAMASUOKAN，etal.HypocholesterolemiceffectofindigestiblefractionofChlorellaregularisincholesterolfedrats[J].Journalofnutritionalscienceandvitaminology，2001，47（6）：373-377.

[4]KONGODIAMOUKALAJU，ZHANGH，IRAKOZEPC.Invitrobindingcapacityofbileacidsbydefattedcornproteinhydrolysate[J].Internationaljournalofmolecularsciences，2011，12（2）：1066-1080.

[6]MULLALLYMM，MEISELH，F(xiàn)ITZGERALDRJ.Angiotensin-I-convertingenzymeinhibitoryactivitiesofgastricandpancreaticproteinasedigestsofwheyproteins[J].Internationaldairyjournal，1997，7（5）：299-303.

[6]PIHLANTOLEPPLA，ROKKAT，KORHONENH.AngiotensinIconvertingenzymeinhibitorypeptidesderivedfrombovinemilkproteins[J].Internationaldairyjournal，1998，8（4）：325-331.

[7]楊鋒，陳錦屏，吳莉莉.醋蛋多肽血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性的穩(wěn)定性研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（11）：151-153，156.

[8]楊鋒，陳錦屏，林心怡.美拉德反應(yīng)對(duì)醋蛋多肽抗氧化活性的影響[J].食品科學(xué)，2013，34（3）：137-140.

[9]STEVENSONDE，OFMANDJ，MORGANKR，etal.Proteasecatalyzedcondensationofpeptidesasapotentialmeanstoreducethebittertasteofhydrophobicpeptidesfoundinproteinhydrolysates[J].Enzymeµbialtechnology，1998，22（2）：100-110.

[10]ASHLEYDV，TEMLERR，BARCLAYD，etal.Aminoacidenrichedplasteins：Asourceoflimitingaminoacidsfortheweanlingrat[J].Journalofnutrition，1983，113（1）：21-27.

[11]YAMASHITAM，ARAIS，AMANOY，etal.Anovelonestepprocessforenzymaticincorporationofaminoacidsintoproteins：Applicationtosoyproteinandflourforenhancingtheirmethioninelevels[J].Agriculturalandbiologicalchemistry，1979，43（5）：1065-1068.

[12]QIANF，WANGY，WENZJ，etal.Plasteinreactionenhancedbile-acidbindingcapacityofsoybeanproteinhydrolysatesandwheyproteinhydrolysates[J].Journaloffoodscience&technology，2018，55（3）：1021-1027.

[13]HOWARDA，UDENIGWECC.Mechanismsandprospectsoffoodproteinhydrolysatesandpeptideinducedhypolipidaemia[J].Food&function，2013，4（1）：41-50.

[14]UDENIGWECC，MOHANA，WUSH.Peptideaggregationduringplasteinreactionenhancedbileacidbindingcapacityofenzymaticchickenmeathydrolysates[J].Journaloffoodbiochemistry，2015，39（3）：344-348.

[15]CHURCHFC，SWAISGOODHE，PORTERDH，etal.Spectrophotometricassayusingophthaldialdehydefordeterminationofproteolysisinmilkandisolatedmilkproteins[J].Journalofdairyscience，1983，66（6）：1219-1227.

[16]SPELLMAND，MCEVOYE，OCUINNG，etal.Proteinaseandexopeptidasehydrolysisofwheyprotein：ComparisonoftheTNBS，OPAandpHstatmethodsforquantificationofdegreeofhydrolysis[J].Internationaldairyjournal，2003，13（6）：447-453.

[17]ADLERNISSENJ.Determinationofthedegreeofhydrolysisoffoodproteinhydrolysatesbytrinitrobenzenesulfonicacid[J].Journalofagriculturalandfoodchemistry，1979，27（6）：1256-1262.

[18]SAIGAA，TANABES，NISHIMURAT.Antioxidantactivityofpeptidesobtainedfromporcinemyofibrillarproteinsbyproteasetreatment[J].Journalofagriculturalandfoodchemistry，2003，51（12）：3661-3667.

[19]SUNH，LITJ，ZHAOXH.AceInhibitionandenzymaticresistanceinvitroofacaseinhydrolysatesubjectedtoplasteinreactioninthepresenceofextrinsicprolineandethanolormethanolwaterfractionation[J].Internationaljournaloffoodproperties，2014，17（2）：386-398.

[20]ZHANGY，ZHAOXH.InvitroangiotensinI-convertingenzymeinhibitionofcaseinhydrolysateresponsibleforplasteinreactioninethanol-watermedium，solventfractionation，andproteasedigestion[J].Internationaljournaloffoodproperties，2014，17（7）：1577-1590.

[21]WEIX，LITJ，ZHAOXH.CoupledneutrasecatalyzedplasteinreactionmediatedtheACE-Inhibitoryactivityinvitroofcaseinhydrolysatespreparedbyalcalase[J].Internationaljournaloffoodproperties，2013，16（2）：429-443.

[22]LINYH，TSAIJS，CHENGW.Purificationandidentificationofhypocholesterolemicpeptidesfromfreshwaterclamhydrolysatewithinvitrogastrointestinaldigestion[J].Journaloffoodbiochemistry，2017，41（4）：12385.

[23]UDENIGWECC，WUSH，DRUMMONDK，etal.Revisitingtheprospectsofplastein：Thermalandsimulatedgastricstabilityinrelationtotheantioxidativecapacityofcaseinplastein[J].Journalofagriculturalandfoodchemistry，2014，62（1）：130-135.

[24]HIGAKIN，SATOK，SUDAH，etal.Evidencefortheexistenceofasoybeanresistantproteinthatcapturesbileacidandstimulatesitsfecalexcretion[J].JournaloftheagriculturalchemicalsocietyofJapan，2006，70（12）：2844-2852.

[25]BROWNSELLVL，WILLIAMSRJH，ANDREWSAT.Applicationoftheplasteinreactiontomycoprotein：II.Plasteinproperties[J].Foodchemistry，2001，72（3）：337-346.