陳蕾蕾 鄧淑怡 劉喚明 鄧楚津

摘要[目的]對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中乳酸菌進(jìn)行篩選并對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行研究。[方法]首先利用含碳酸鈣的MRS固體培養(yǎng)基從蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的海水和底泥中篩選出有溶鈣圈的菌株M5;接著根據(jù)16SrDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析對(duì)菌株M5進(jìn)行鑒定，最后在單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]初步鑒定菌株M5為糞腸球菌，該菌株的最佳發(fā)酵工藝為：甘蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀的濃度為0.5%，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時(shí)間為48h。在以上工藝下，發(fā)酵液中乳酸菌的活菌數(shù)高達(dá)4.97×108CFU/mL。[結(jié)論]本研究對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖所用乳酸菌的發(fā)酵生產(chǎn)具有一定的參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境;乳酸菌;篩選;發(fā)酵工藝

中圖分類號(hào)S968.22文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）01-0087-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.01.027

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，抗生素由于具有高效、快速和廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛使用。在對(duì)蝦的養(yǎng)殖中，常用的抗生素有恩諾沙星、土霉素、頭孢、呋喃烯酮酸等。研究表明，傳統(tǒng)的抗生素等抗菌化學(xué)藥物的大量使用甚至濫用不僅擾亂了對(duì)蝦腸道正常的菌群，引起耐藥菌株的產(chǎn)生，而且造成環(huán)境中藥物的殘留，最終威脅著人類的健康和安全，這些問(wèn)題已引起了人們廣泛的關(guān)注與焦慮[3]，因此，尋找抗生素類化學(xué)藥物的替代品成為對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵和熱點(diǎn)[4]。

乳酸菌可代替抗生素在水質(zhì)改良、治療水產(chǎn)動(dòng)物疾病以及水產(chǎn)動(dòng)物免疫等方面的應(yīng)用[5]。有研究表明采用乳酸菌拌料投喂凡納濱對(duì)蝦6周后，對(duì)蝦的免疫力增強(qiáng)，成活率以及弧菌的抵抗力均增強(qiáng)[6];乳酸菌可以抑制對(duì)蝦養(yǎng)殖過(guò)程中副溶血性弧菌的生長(zhǎng)[7];張玲等[8]研究結(jié)果表明，通過(guò)口服與浸浴的方式對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦和日本囊對(duì)蝦施用乳酸菌，能有效調(diào)節(jié)腸道微生物菌群組成，改善養(yǎng)殖水質(zhì)，提高對(duì)蝦的成活率，提高對(duì)白斑綜合癥和副溶血弧菌病的抗病力。因此科學(xué)施用益生菌是替代當(dāng)前對(duì)蝦養(yǎng)殖中的化學(xué)藥物療法、構(gòu)建環(huán)境友好型對(duì)蝦養(yǎng)殖模式的必由之路[9]。

另外從對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中篩選乳酸菌報(bào)道較少，且從對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中篩選的乳酸菌應(yīng)用于對(duì)蝦養(yǎng)殖有更好的適應(yīng)性。本研究將從對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境篩選乳酸菌，對(duì)其發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，為對(duì)蝦養(yǎng)殖中乳酸菌的應(yīng)用提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)原料。

菌株篩選樣品：對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的海水和底泥。

1.1.2培養(yǎng)基。

乳酸菌初篩培養(yǎng)基：蛋白胨15g，牛肉膏5g，氯化鈉5g，葡萄糖20g，瓊脂粉10g，碳酸鈣10g，水1000mL，pH6.2～6.6，121℃滅菌20min，滅菌后放置水浴52℃?zhèn)溆谩?/p>

乳酸菌計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：MRS固體培養(yǎng)基。

1.1.3試驗(yàn)儀器。

SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，MJX-160B-Z型霉菌培養(yǎng)箱，SW-CJ-2F型潔凈工作臺(tái)，均由上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn);GZX-9240MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱，由上海精密科技有限公司生產(chǎn);LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋，由上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司生產(chǎn)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1乳酸菌的篩選。

將對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的水和底泥梯度稀釋后，涂布于初篩培養(yǎng)基上，將平板置于37℃培養(yǎng)48h。根據(jù)菌落是否具有溶鈣圈，以及其顏色、大小、光澤等，挑取疑似乳酸菌的單菌落，進(jìn)行革蘭氏染色檢驗(yàn)。凡是革蘭氏染色陽(yáng)性的菌落，在MRS培養(yǎng)基上平板劃線分離純化培養(yǎng)2次，斜面保存。

1.2.2乳酸菌的鑒定。

將篩選出的菌株的16SrDNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增成功后的PCR產(chǎn)物送到上海生工公司測(cè)序，測(cè)序成功后得到的結(jié)果遞交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比對(duì)，再進(jìn)行相似同源性分析，然后用Maximumlikelihood法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹、BOOTSTRAP分析法分析，最后選取重復(fù)1000來(lái)評(píng)估樹的準(zhǔn)確性[10-13]。

1.2.3乳酸菌的計(jì)數(shù)方法

乳酸菌的計(jì)數(shù)使用MRS培養(yǎng)基，將需要計(jì)數(shù)的樣品進(jìn)行梯度稀釋后，涂布于MRS培養(yǎng)基，選取菌落數(shù)在30～300之間平板計(jì)數(shù)，1個(gè)稀釋度選擇兩個(gè)平板。

1.2.4單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝。

①糖蜜濃度的優(yōu)化。選取5%、10%、15%、20%、25%甘蔗糖蜜濃度作為碳源，37℃發(fā)酵培養(yǎng)48h，測(cè)定發(fā)酵液中乳酸菌活菌數(shù)。②蛋白胨濃度的優(yōu)化。甘蔗糖蜜濃度為5%，添加蛋白胨作為有機(jī)氮源，6組的添加量分別為0%、0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.25%，37℃發(fā)酵培養(yǎng)48h，測(cè)定發(fā)酵液中乳酸菌活菌數(shù)。③硫酸銨濃度的優(yōu)化。甘蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，添加硫酸銨作為無(wú)機(jī)氮源，6組的添加量分別為0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，37℃發(fā)酵培養(yǎng)48h，測(cè)定發(fā)酵液中乳酸菌活菌數(shù)。④磷酸氫二鉀濃度的優(yōu)化。甘蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，硫酸銨濃度為0.5%，添加磷酸氫二鉀作為磷源，6組的添加量分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，測(cè)定發(fā)酵液中乳酸菌活菌數(shù)。⑤發(fā)酵溫度的優(yōu)化。甘蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀的濃度為0.5%，接種。分別在30℃、33℃以及37℃培養(yǎng)24h，測(cè)定發(fā)酵液中乳酸菌活菌數(shù)。⑥發(fā)酵時(shí)間的優(yōu)化。蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀的濃度為0.5%，配制發(fā)酵培養(yǎng)基，接種。在37℃下培養(yǎng)6h、12h、18h、24h、48h、72h，分別測(cè)定發(fā)酵液中乳酸菌活菌數(shù)。

1.2.5正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝。

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取糖蜜濃度、蛋白胨濃度、硫酸銨濃度及磷酸氫二鉀濃度進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)因素和水平如表1所示

2結(jié)果與分析

2.1乳酸菌16SrDNA鑒定

將菌株M5的測(cè)序結(jié)果，通過(guò)NCBI進(jìn)行16SrDNA數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST，M5與標(biāo)準(zhǔn)菌株EnterococcusfaecalisATCC19433的相似性最高，高達(dá)99.8%。選取序列相似度達(dá)99%的部分菌種，采用軟件Mega5.05，Maximumlikelihood法制作系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。由圖1結(jié)果可知，菌株M5在系統(tǒng)發(fā)育樹上與EnterococcusfaecalisATCC19433在同一支系。綜合以上分析，可初步鑒定菌株M5為糞腸球菌。

2.2乳酸菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化

2.2.1糖蜜濃度對(duì)乳酸菌發(fā)酵的影響。

由圖2結(jié)果可知，在發(fā)酵溫度和時(shí)間相同的條件下，糖蜜濃度為5%時(shí)，乳酸菌發(fā)酵液中活菌數(shù)最多。當(dāng)糖蜜濃度過(guò)高，乳酸菌代謝加快，產(chǎn)物積累，導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH過(guò)低，抑制乳酸菌發(fā)酵。

2.2.2蛋白胨濃度對(duì)乳酸菌發(fā)酵的影響。

由圖3結(jié)果所示，隨著蛋白胨濃度的增加，發(fā)酵液中乳酸菌活菌數(shù)先增加后減少，當(dāng)?shù)鞍纂藵舛葹?.5%時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)最多。

2.2.3硫酸銨濃度對(duì)乳酸菌發(fā)酵的影響。

由圖4結(jié)果可知，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源以及有機(jī)氮源濃度為最優(yōu)，發(fā)酵溫度及時(shí)間相同的條件下，當(dāng)硫酸銨濃度為0.4%時(shí)，乳酸菌的活菌數(shù)最多。

2.2.4磷酸氫二鉀濃度對(duì)乳酸菌發(fā)酵的影響。

由圖5結(jié)果可知，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源、有機(jī)氮源以及無(wú)機(jī)氮源濃度最佳，發(fā)酵溫度及時(shí)間相同的條件下，磷酸氫二鉀濃度為0.4%時(shí)，乳酸菌的活菌數(shù)最多。

2.2.5發(fā)酵溫度對(duì)乳酸菌發(fā)酵的影響。

由圖6結(jié)果可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為30℃時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)最多。發(fā)酵溫度升高后，乳酸菌活菌數(shù)減少，因此，最佳發(fā)酵溫度應(yīng)選擇30℃。

2.2.6發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌發(fā)酵的影響。

由圖7結(jié)果可知：發(fā)酵時(shí)間小于48h，乳酸菌在正常的發(fā)酵繁殖，活菌數(shù)逐漸增多;在48h左右，活菌數(shù)達(dá)到最大值;在48h之后，乳酸菌數(shù)目開始逐漸減少，甚至在96h時(shí)，乳酸菌活菌數(shù)幾乎為0。因此，最佳發(fā)酵時(shí)間為48h。

2.2.7正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵工藝。

在單因子實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如表2所示，由表2可知，各因素的最佳水平為A1B3C3D3，即甘蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，硫酸銨濃度為0.5%，磷酸氫二鉀濃度為0.5%，并且在以上工藝下，發(fā)酵液中乳酸菌活菌數(shù)達(dá)到4.97×108CFU/mL，R值的大小分別為A>C>D>B。

3結(jié)論與討論

該試驗(yàn)采用從對(duì)蝦養(yǎng)殖環(huán)境中的海水和底泥篩選出的乳酸菌作為菌種，利用革蘭氏染色和16SrDNA基因序列分析進(jìn)行乳酸菌的鑒定，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)，確定了糞腸球菌M5的最佳發(fā)酵工藝為：甘蔗糖蜜濃度為5%，蛋白胨濃度為0.75%，硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀的濃度為0.5%，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵時(shí)間為48h。在以上工藝下，發(fā)酵液中的乳酸菌的活菌數(shù)高達(dá)4.97×108CFU/mL，對(duì)對(duì)蝦養(yǎng)殖所用乳酸菌的發(fā)酵生產(chǎn)有一定的參考價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1]程秀玉，王炎松.海南省養(yǎng)殖南美白對(duì)蝦藥物殘留檢測(cè)[J].熱帶農(nóng)業(yè)工程，2016，40（3）：1-3.

[2]桂建芳.水生生物學(xué)科學(xué)前沿及熱點(diǎn)問(wèn)題[J].科學(xué)通報(bào)，2015，60（22）：2051-2057.

[3]ESIOBUN，ARMENTAL，IKEJ.Antibioticresistanceinsoilandwaterenvironments[J].IntJEnvironHealthRes，2002，12（2）：133-144.

[4]WANGYB，LIJR，LINJD.Probioticsinaquaculture：Challengesandoutlook[J].Aquaculture，2008，281（1/2/3/4）：1-4.

[5]張家國(guó)，劉翠玲.乳酸菌代替抗生素在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用[J].中國(guó)水產(chǎn)，2014（7）：66-68.

[6]KONGNUMK，HONGPATTARAKERET.EffectofLactobacillusplantarumisolatedfromdigestivetractofwildshrimpongrowthandsurvivalofwhiteshrimp（Litopenaeusvannamei）challengedwithVibrioharveyi[J].Fish&shellfishimmunology，2012，32（1）：170-177.

[7]WANGW，LIM，F(xiàn)ANGWH，etal.ApredictivemodelforassessmentofdecontaminationeffectsoflacticacidandchitosanusedincombinationonVibrioparahaemolyticusinshrimps[J].Internationaljuornaloffoodmicrobiology，2013，167（2）：124-130.

[8]張玲.一株對(duì)蝦腸道益生菌的篩選及其作用機(jī)理和應(yīng)用效果的研究[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2007.

[9]文金順.海南土著乳酸菌篩選及其對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)影響的研究[D].?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2017.

[10]楊吉霞，張利玲，蔣厚陽(yáng)，等.眉山泡菜中乳酸菌的分離鑒定[J].食品科學(xué)，2015，36（17）：158-163.

[11]華鶴良.乳酸菌的分離鑒定及其抗菌肽與發(fā)酵性能研究[D].揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2014.

[12]曾議霆，郭溪浪，周康，等.富硒乳酸菌的篩選及鑒定[J].食品科學(xué)，2015，36（3）：178-182.

[13]凌代文.乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1999：1-25.