吳淑春，梁赤周，虞 淼，徐 永，韓劍眾

(1.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310018；2.杭州醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；3.浙江省農(nóng)藥檢定管理總站，浙江 杭州 310020)

乙基多殺菌素(spinetoram)是由美國(guó)陶氏益農(nóng)公司開(kāi)發(fā)的一種新型多殺菌素類殺菌劑[1]，有效成分為乙基多殺菌素-J(代號(hào)為XDE-175-J)和乙基多殺菌素-L(代號(hào)為XDE-175-L)的混合物(結(jié)構(gòu)圖1)，乙基多殺菌素-J約占75.5%，乙基多殺菌素-J(22.5℃)外觀為白色粉末，乙基多殺菌素-L(22.9℃)外觀為白色至黃色晶體，帶苦杏仁味，在pH 5～7緩沖溶液中乙基多殺菌素-J和乙基多殺菌素-L都是穩(wěn)定的。乙基多殺菌素主要作用于昆蟲(chóng)神經(jīng)中煙堿型乙酰膽堿受體和γ-氨基丁酸受體，致使蟲(chóng)體對(duì)興奮性或抑制性的信號(hào)傳遞反應(yīng)不敏感直至死亡[2]。乙基多殺菌素具有胃毒和觸殺作用，主要用于防治鱗翅目幼蟲(chóng)、薊馬和潛葉蠅等，對(duì)小菜蛾、甜菜夜蛾、潛葉蠅、薊馬、斜紋夜蛾、豆莢螟等有好的防治效果。目前乙基多殺菌素懸浮劑、水分散粒劑已在我國(guó)水稻、甘藍(lán)、茄子、黃瓜、豇豆、西瓜、楊梅和芒果上已獲準(zhǔn)登記使用，并已制定了稻谷、糙米、結(jié)球甘藍(lán)、茄子、豇豆上的臨時(shí)最大殘留限量[3]。

農(nóng)藥殘留聯(lián)席會(huì)議(JMPR)報(bào)告研究指出[4]，乙基多殺菌素在植物源樣品中的主要代謝物為N-demethyl-175-J和N-formyl-175-J(結(jié)構(gòu)圖1)，對(duì)乙基多殺菌素進(jìn)行膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，需要乙基多殺菌素-J、乙基多殺菌素-L、N-demethyl-175-J和N-formyl-175-J的殘留量。

目前已報(bào)道的關(guān)于乙基多殺菌素在環(huán)境中殘留分析方法主要有液相色譜法(LC)[5-8]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[9-10]，這些分析方法均只檢測(cè)了乙基多殺菌素母體，傅強(qiáng)等[11]用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)水稻樣品中乙基多殺菌素及其代謝物的殘留量進(jìn)行了研究。王天玉等[12]研究了高效液相色譜法檢測(cè)楊梅中乙基多殺菌素母體的方法。本研究采用LC-MS/MS分析方法，同時(shí)檢測(cè)楊梅樣品中乙基多殺菌素及其代謝物的殘留量和降解規(guī)律，旨在為乙基多殺菌素在楊中的膳食風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估、制定農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)提供分析方法，也為進(jìn)一步探究乙基多殺菌素及其代謝物對(duì)非靶標(biāo)生物的毒性效應(yīng)和農(nóng)藥的合理安全使用提供參考依據(jù)。為此，我們?cè)谡憬∨_(tái)州市、浙江省寧波市、福建省建陽(yáng)市、福建省建甌市開(kāi)展了60g/L乙基多殺菌素懸浮劑在楊梅上的殘留田間試驗(yàn)。

圖1 乙基多殺菌素及其主要代謝物結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 藥劑及試劑 標(biāo)準(zhǔn)品96.7%的乙基多殺菌素(其中乙基多殺菌素-J 76.7%，乙基多殺菌素-L 20%)、98%的N-Formyl-175-J和99%的N-Demethyl-175-J，乙腈(HPLC級(jí)),甲醇(HPLC級(jí))，氯化鈉(AR級(jí))，二氯甲烷(AR級(jí))，乙酸銨(色譜純)，乙酸(分析純)，Strata NH2柱(500mg/6mL)，微孔有機(jī)濾膜(0.22 μm)。

1.1.2 儀器設(shè)備 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(LC-MS-MS)(Waters Xevo TQ)，氮吹儀(N-EVAP 112)，電子天平(PL202-L Ⅲ)，超純水凈化系統(tǒng)(Milli-Q)，漩渦混合器(IKA)，調(diào)速多用振蕩器(HY-2)，電熱恒溫水浴鍋。

1.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì) 按農(nóng)藥殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則要求設(shè)試驗(yàn)小區(qū)，3株楊梅樹(shù)為1個(gè)試驗(yàn)小區(qū)，每個(gè)處理3個(gè)小區(qū)重復(fù)，小區(qū)間設(shè)保護(hù)行，同時(shí)設(shè)不施藥小區(qū)對(duì)照。60g/L乙基多殺菌素懸浮劑防治楊梅果蠅，企業(yè)推薦使用藥量為有效成分40mg/kg，噴霧施藥1次。

1.2.1 消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn) 楊梅成熟一半大小時(shí)，按有效成分60mg/kg的劑量均勻噴霧施藥1次，施藥后2h,1、2、3、5、7、10、14、21d，按照殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則果樹(shù)樣品采樣要求，在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)采摘生長(zhǎng)正常、無(wú)病害的楊梅果實(shí)，每小區(qū)采摘量≥2kg。

1.2.2 最終殘留試驗(yàn) 楊梅成熟前半個(gè)月左右，按有效成分40和60mg/kg施藥劑量，各施藥1次和2次，施藥間隔7d。末次施藥后1、2、3、5、7d，按照殘留試驗(yàn)準(zhǔn)則果樹(shù)樣品采樣要求，在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)隨機(jī)采摘生長(zhǎng)正常、無(wú)病害的楊梅果實(shí)，每小區(qū)≥2kg。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品前處理 田間樣品處理：田間樣品采集后，8h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。楊梅去核后用食物調(diào)理機(jī)打成均勻漿狀，150g樣品2份，分別裝入封口樣品容器中，-20℃凍存。

提取與凈化：稱取處理好的楊梅試樣25.0g(精確至0.01g)于250mL燒杯中，加入50.0mL乙腈，高速勻漿2min，用濾紙過(guò)濾至裝有5～7g氯化鈉的100mL具塞量筒中，塞緊后劇烈震蕩1min，在室溫下靜置30min，使水相和乙腈相分層，從具塞量筒中吸取上層有機(jī)相10.0mL于50mL燒杯中，置于80℃水浴鍋上，氮吹至近干，加入2.0mL甲醇:二氯甲烷(1∶9，V/V)溶劑，充分溶解，待凈化。將氨基柱用4.0mL甲醇+二氯甲烷(V∶V=10∶90)預(yù)洗，當(dāng)液面到達(dá)柱吸附層表面時(shí)，加入上述待凈化溶液凈化，洗脫液用15mL離心管收集，洗燒杯用4.0mL甲醇+二氯甲烷(V∶V=10∶90)洗滌2次并過(guò)柱。然后將離心管置于氮吹儀，水浴溫度為50℃，氮吹蒸發(fā)至近干，甲醇定容至5mL，在混合器上混均后，用0.22μm濾膜過(guò)濾，LC-MS-MS測(cè)定。

1.3.2 液相色譜條件 色譜柱：Phenomenex XB-C18(100mm×2.1mm×2.6μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)和5mmol乙酸銨-0.1%乙酸緩沖溶液(B)；流動(dòng)相速度：0.2mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：5μL。液相梯度洗脫程序(表1)。

表1 液相梯度洗脫程序

1.3.3 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；離子源溫度：150℃；電離方式：ES+；監(jiān)測(cè)方式：MRM；毛細(xì)管電壓：3.0kV；脫溶劑氣溫度：500℃；脫溶劑氣流速：800L/h；錐孔反吹氣流速：40L/h；碰撞氣流速：0.15mL/min；定量方式：外標(biāo)法。質(zhì)譜條件(表2)。

表2 乙基多殺菌素測(cè)定的ES-MS-MS條件

*定量離子

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線 將乙基多殺菌素及其代謝物分別溶解于甲醇，配制成500mg/L的母液，再分別移取1mL各母液至50mL容量瓶，甲醇定容，配成10mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后用甲醇稀釋成0.02、0.1、0.2、1.0、2.0μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.3的儀器條件測(cè)定。以進(jìn)樣質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)、響應(yīng)值(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，外標(biāo)法定量。

1.3.5 添加回收 向空白楊梅樣品中分別添加0.05、0.5、1.0mg/kg的乙基多殺菌素及其代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(在此添加水平下，乙基多殺菌素-J的添加濃度相當(dāng)于0.04、0.4、0.8mg/kg，乙基多殺菌素-L的添加濃度相當(dāng)于0.01、0.1、0.2mg/kg)，采用所建立的方法測(cè)定其添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。每個(gè)添加水平重復(fù)5次，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性范圍 在0.02～2.0μg/L范圍內(nèi)，以監(jiān)測(cè)離子峰面積(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度(x)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，乙基多殺菌素及其代謝物線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(R2)在0.993 3～1.0之間(表3)。

表3 乙基多殺菌素及其代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

2.2 回收率和精密度 乙基多殺菌素及其代謝物在楊梅樣品中的添加回收試驗(yàn)結(jié)果(表4)，當(dāng)乙基多殺菌素-J 添加濃度為0.04、0.4和0.8mg/kg，乙基多殺菌素-L 的添加濃度為0.01、0.1、0.2mg/kg，代謝物的添加水平為0.05、0.5、1.0mg/kg，平均回收率在82.6%～96.6%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.3%～7.4%之間，方法的精密度和準(zhǔn)確度均較好，符合農(nóng)藥殘留分析的要求[13]。乙基多殺菌素-J和乙基多殺菌素-L在楊梅樣品中的定量限分別為0.04mg/kg和0.01mg/kg，代謝物N-demethyl-175-J和N-formyl-175-J的定量限為0.05mg/kg。楊梅添加回收試驗(yàn)典型譜圖(圖2～圖4)。

表4 乙基多殺菌素及其代謝物在楊梅中添加回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

圖2 乙基多殺菌素及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1mg/L)的MRM質(zhì)譜圖

圖3 楊梅空白樣品的MRM質(zhì)譜圖

圖4 楊梅添加樣品(0.05mg/kg)的MRM質(zhì)譜圖

2.3 消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn) 60g/L乙基多殺菌素懸浮劑以有效成分60mg/kg劑量噴霧施藥，浙江臺(tái)州、浙江寧波、福建建陽(yáng)、福建建甌4試驗(yàn)地楊梅中的乙基多殺菌素的降解符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程，相關(guān)系數(shù)(R2)在0.929 8～0.976 5之間，半衰期為0.9～2.6d，降解速度較快。乙基多殺菌素在楊梅中的消解動(dòng)力學(xué)參數(shù)(表5)。

表5 乙基多殺菌素在楊梅中的消解動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.4 最終殘留試驗(yàn) 最終殘留試驗(yàn)結(jié)果表明，60g/L乙基多殺菌素懸浮劑分別按照40和60mg/kg的劑量，施藥1次和2次，施藥后1、2、3、5、7d，楊梅中乙基多殺菌素(乙基多殺菌素-J和乙基多殺菌素-L之和)最終殘留量分別為<0.05～0.38、<0.05～0.39、<0.05～0.32、<0.05～0.19、<0.05～0.11mg/kg，乙基多殺菌素在楊梅中的最終殘留規(guī)律明顯，殘留量隨著采收間隔期的延長(zhǎng)而降低。代謝物N-demethyl-175-J和N-formyl-175-J的殘留量均<0.05mg/kg。乙基多殺菌素在楊梅中殘留量詳細(xì)數(shù)據(jù)(表6)。

表6 乙基多殺菌素在楊梅中的殘留量

3 結(jié)論與討論

3.1 果蠅是對(duì)楊梅生產(chǎn)影響最大的蟲(chóng)害之一，尤其是楊梅上市前期。乙基多殺菌素對(duì)果蠅的防治有很好的效果[14]，從本試驗(yàn)結(jié)果看，乙基多殺菌素在楊梅中的平均消解半衰期只有0.9～2.6d，降解速度非?？?，這對(duì)保證消費(fèi)者安全非常有利。

3.2 目前我國(guó)、CAC及其他國(guó)家都未規(guī)定乙基多殺菌素在楊梅上的最大殘留限量。GB 2763-2018.1中規(guī)定了乙基多殺菌素在相關(guān)水果上的臨時(shí)最大殘留限量分別為：橙子0.07mg/kg,仁果類水果0.05mg/kg,桃和油桃0.3mg/kg,藍(lán)莓0.2mg/kg,覆盆子0.8mg/kg,葡萄0.3mg/kg。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，用藥量40～60mg/kg，施藥1～2次，末次施藥后7d，乙基多殺菌素在楊梅中的最終殘留量為<0.05～0.11mg/kg。建議我國(guó)乙基多殺菌素在楊梅上的最大殘留限量值為0.5mg/kg。

3.3 建議使用60g/L乙基多殺菌素懸浮劑防治楊梅果蠅，有效成分用藥量40mg/kg，施藥1次，安全間隔期7d。