吳佳，匡艷輝

1.長(zhǎng)沙民政職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.廣州白云山和記黃埔中藥有限公司，廣東 廣州 510515

黃連為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.、三角葉黃連CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao或云連CoptisteetaWall.的干燥根莖。以上三種分別習(xí)稱“味連”、“雅連”和“云連”。主要分布于我國(guó)重慶、湖北、四川、云南等地。其味苦，性寒。歸心、脾、胃、肝、膽、大腸經(jīng)。具有清熱燥濕，瀉火解毒之功效[1-2]。

味連、雅連和云連受到政策指導(dǎo)、市場(chǎng)價(jià)格、每畝產(chǎn)量等多方面因素的影響，分布呈極端情況。據(jù)實(shí)際調(diào)查和樣品收集，目前味連在市場(chǎng)上占絕對(duì)主導(dǎo)地位，而雅連和云連在市場(chǎng)上基本沒(méi)有發(fā)現(xiàn)。2015版《中華人民共和國(guó)藥典》一部中只有味連的含量測(cè)定項(xiàng)，卻沒(méi)有雅連和云連的含量測(cè)定項(xiàng)。通過(guò)大量文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，雅連和云連中生物堿的質(zhì)量控制方法多為紫外分光光度法或薄層色譜法[3]。雅連和云連同為黃連的重要品種，為了黃連藥用資源的可持續(xù)發(fā)展，本研究擬收集雅連和云連樣品，采用HPLC法制定雅連和云連的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

有文獻(xiàn)檢測(cè)了不同產(chǎn)地和品種黃連藥材中的總生物堿，發(fā)現(xiàn)不同基原的黃連中總生物堿的含量有差異[4]；有研究檢測(cè)了不同產(chǎn)地和品種黃連中鹽酸小檗堿、鹽酸巴馬汀和藥根堿的含量，也發(fā)現(xiàn)不同基原的黃連中這幾種生物堿的含量有差異[5]。我們總共收集到了5批雅連藥材和10批云連藥材，對(duì)上述黃連藥材進(jìn)行了含量測(cè)定，為雅連和云連的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供指導(dǎo)依據(jù)。

1 方法學(xué)的建立

1.1 混合對(duì)照品溶液的制備

精密分別稱取5個(gè)生物堿：鹽酸藥根堿、鹽酸表小檗堿、鹽酸黃連堿、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿4.39、2.59、2.39、4.90、28.78 mg，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解，并定容至刻度，搖勻，得各對(duì)照品溶液；分別精密量取各對(duì)照品溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即為混合對(duì)照溶液，4 ℃冰箱中保存，備用。

1.2 供試品溶液的制備

取雅連或云連藥材粉末(40目)約0.2 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，精密加入甲醇-鹽酸(100∶1)溶液50 mL，稱重，超聲30 min，冷卻，加甲醇補(bǔ)足重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)0.45 μm濾膜，即得。

1.3 色譜條件

色譜柱為Kromasil 100-5 C18(250×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-50 mmol·L-1磷酸二氫鉀溶液(50∶50)(每100 mL中加十二烷基磺酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.0)為流動(dòng)相；柱溫：30 ℃；流速：0.6 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：345 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。在上述色譜條件下，雅連藥材和云連藥材HPLC色譜圖如圖2及圖3所示，色譜圖顯示雅連含有表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿4個(gè)生物堿，而云連則只含有黃連堿、巴馬汀和小檗堿3個(gè)生物堿。上述色譜條件下，對(duì)照品藥根堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿5個(gè)生物堿分離良好。如圖1。

注：1.藥根堿；2.表小檗堿；3.黃連堿；4.巴馬汀；5.小檗堿。圖1 混合對(duì)照品HPLC色譜圖

注：2.表小檗堿；3.黃連堿；4.巴馬??；5.小檗堿。圖2 雅連樣品HPLC色譜圖

注：3.黃連堿；4.巴馬??；5.小檗堿。圖3 云連樣品HPLC色譜圖

1.4 線性范圍

依次將1.1所述混合對(duì)照品溶液稀釋5、10、20、25、50、100、200倍，各進(jìn)樣10 μL分析，每個(gè)體積進(jìn)樣2次，取峰面積積分值的平均值，見(jiàn)表1。以進(jìn)樣量對(duì)峰面積積分值進(jìn)行線性回歸處理，得藥根堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿的回歸直線方程，見(jiàn)表1。

表1 五個(gè)生物堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.5 精密度試驗(yàn)

依次將1.1所述混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，記錄藥根堿、表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿的峰面積，得出日內(nèi)精密度見(jiàn)表2。

表2 五個(gè)生物堿的精密度

1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取云連供試品溶液，分別于配制后的0、2、4、8、12、24、48 h進(jìn)樣，每次10 μL，記錄黃連堿、巴馬汀和小檗堿的峰面積，見(jiàn)表3。表明處理后的樣品在2 d內(nèi)穩(wěn)定。

表3 云連穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取云連藥材粉末共6份，按1.2項(xiàng)下制備樣品，測(cè)得黃連堿、巴馬汀和小檗堿的平均含量和RSD分別見(jiàn)表4。

表4 云連重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 %

1.8 加樣回收率

精密稱取云連藥材粉末約0.1 g共6份，加入適量對(duì)照品，按1.2項(xiàng)下制備樣品進(jìn)行HPLC測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。黃連堿、巴馬汀和小檗堿的平均回收率及RSD見(jiàn)表5。

表5 云連加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2 樣品測(cè)定

按正文含量測(cè)定方法，取5批雅連藥材和10批云連藥材依法測(cè)定，結(jié)果如下，見(jiàn)表6及表7。

表6 雅連樣品中4個(gè)生物堿含量測(cè)定結(jié)果 %

表7 云連樣品中3個(gè)生物堿含量測(cè)定結(jié)果 %

3 討論

黃連的三種不同基原中，味連在市場(chǎng)上占絕對(duì)主導(dǎo)地位，以重慶石柱為道地產(chǎn)區(qū)。這是由于20世紀(jì)50年代，國(guó)家大力扶持中藥材種植，四川、陜西、湖南等地開(kāi)始從重慶石柱引種，之后也形成了穩(wěn)定的種植規(guī)模，湖北利川、恩施等地也擴(kuò)大了種植規(guī)模[4]。雅連傳統(tǒng)以四川峨嵋、洪雅、夾江、雅安等地為道地主產(chǎn)區(qū)。但自50年代起從重慶引種味連后，雅連種植逐漸萎縮[5]。經(jīng)實(shí)地調(diào)查，目前已幾乎沒(méi)有種植生產(chǎn)，其原因在于雅連為“單枝連”，畝(1畝≈666.7 m2)產(chǎn)僅在80～120 kg，而味連畝產(chǎn)在300 kg左右，市場(chǎng)價(jià)格無(wú)差異、種植年限均為5年，所以藥農(nóng)不愿意種雅連。云連僅產(chǎn)于云南局部地區(qū)，也為單枝連，畝產(chǎn)略高于雅連。據(jù)本研究中的實(shí)地調(diào)查，目前僅在云南福貢和鄰近的貢山一帶有種植，近3年種植規(guī)模逐漸擴(kuò)大到接近1萬(wàn)畝，一般4年收獲。由于近3年才開(kāi)始規(guī)?；N植，年限不到，所以現(xiàn)在市場(chǎng)上幾乎沒(méi)云連商品藥材。

味連，雅連和云連三種黃連中的生物堿的種類有所不同，通過(guò)HPLC圖可以看出，雅連中含有表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和小檗堿4個(gè)生物堿，至于是否含有藥根堿還有待繼續(xù)研究。而云連中則含有黃連堿、巴馬汀和小檗堿3個(gè)生物堿，所收集的樣品中暫時(shí)沒(méi)有檢測(cè)到藥根堿和表小檗堿。而潘正等[6-7]同時(shí)測(cè)定云連藥材中6種生物堿的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，云連藥材中6種生物堿的平均含量差異較大，其中鹽酸小檗堿最高，表小檗堿含量最低，甚至有些批次沒(méi)有檢測(cè)到，間接證明了云連中表小檗堿的含量較低，甚至難以檢測(cè)出來(lái)。而該研究中檢測(cè)出了藥根堿，導(dǎo)致這樣的結(jié)果差異可能與收集的藥材產(chǎn)地有一定的關(guān)系。

崔燦[8]對(duì)四川、湖北、重慶、陜西和云南等產(chǎn)地所產(chǎn)的黃連中生物堿含量的測(cè)定結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地黃連的各種生物堿含量和總生物堿含量有明顯差異，表明黃連的生物堿含量與黃連生長(zhǎng)環(huán)境有密切關(guān)系。這再次證明了味連、雅連和云連中生物堿種類存在差異。

本文首次對(duì)雅連和云連中的生物堿種類進(jìn)行比較，并利用其種類的差異為區(qū)分黃連品種提供依據(jù)，而化學(xué)成分方面的差異是否會(huì)導(dǎo)致藥理藥效方面的差異則有待進(jìn)一步的研究。