姚怡瑋，徐靜，楊萌，李燕呢，何美軍，郭坤元，吳斌*

1.中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.北京市海淀區(qū)植物組織培養(yǎng)技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；3.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 中藥材研究所，湖北 恩施 445000

野葛Puerarialobata(Willd.)Ohwi.為豆科Leguminosae葛屬Pueraria多年生木質(zhì)藤本植物，是一種大宗重要中藥材，于2002年被國(guó)家衛(wèi)生部認(rèn)定為藥食兩用植物。野葛以其干燥根入藥，稱為葛根[1]，具有提高大腦記憶能力、改善和治療心腦血管疾病、抗腫瘤、保肝、消炎鎮(zhèn)痛等功效[2-3]，其主要生物活性成分為異黃酮類物質(zhì)[4]。此外，野葛還富含淀粉、膳食纖維以及人體必需的多種氨基酸、礦物質(zhì)和微量元素，在保健品開(kāi)發(fā)方面具有不錯(cuò)的市場(chǎng)前景。近些年大量研究者對(duì)于野葛的化學(xué)成分[5]、藥理作用[6]、代謝途徑解析及關(guān)鍵酶基因[7]方面進(jìn)行了研究。

microRNA(miRNA)是一類由內(nèi)源基因產(chǎn)生的、長(zhǎng)度約為20～24 nt的非編碼RNA。在植物中，miRNA通常來(lái)自于含有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物(pre-miRNA)，接著在Dicer等一系列酶的作用下產(chǎn)生成熟的miRNA[8-9]。miRNA主要通過(guò)切割靶基因或者抑制其翻譯在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而在植物組織形態(tài)建成[10]、抗病[11]、非生物脅迫[11]、次生代謝產(chǎn)物合成[12]等方面起到了重要作用。然而迄今，在野葛上未見(jiàn)報(bào)道。

由于植物中miRNA在序列上具有高度保守性[13]，除了高通量測(cè)序結(jié)合計(jì)算機(jī)分析鑒定[14]，也可以利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)其保守miRNA[15]。即從miRBase下載已知的miRNA，將其與所研究的物種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)比對(duì)，然后將比對(duì)上的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊，再根據(jù)miRNA的判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選，該方法被廣泛用于植物miRNA的鑒定[16-17]，在一些藥用植物，比如毛地黃[18]、甘草[19]、黃芪[20]中有過(guò)報(bào)道。本研究首次預(yù)測(cè)了野葛中保守miRNA及其靶基因，為今后解析miRNA在野葛防御反應(yīng)、次生代謝產(chǎn)物合成等方面的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

于湖北省恩施州華中藥用植物園試驗(yàn)基地采集2年生野葛P.lobata的根、莖和葉，凍于液氮中，然后保存在-80 ℃冰箱用于RNA的提取。

2 方法

2.1 已知植物miRNA序列的獲得

從miRBase(http：//www.mirbase.org/)中下載全部miRNA序列(版本22)，作為預(yù)測(cè)野葛中保守miRNA的參考序列。

2.2 野葛轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及注釋文件的獲得

從GitHub(https：//github.com/rongchunhan/Pueraria_lobata/commits/master/Pueraria_lobata_contigs.fa)下載野葛的轉(zhuǎn)錄組序列和注釋信息，該序列是Han等測(cè)得[6]，由不同組織(葉、莖、幼嫩根、成熟根、根維管束)的測(cè)序數(shù)據(jù)混合拼接得來(lái)。

2.3 野葛miRNA的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

利用psRobot軟件[21]的前體預(yù)測(cè)模塊“psRobot-mir”，將上述miRNA序列與轉(zhuǎn)錄組拼接數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，采用默認(rèn)參數(shù)，輸入文件格式均為fasta格式。psRobot內(nèi)置mfold 3.5軟件(http：//www.bioinfo. rpi.edu/applications/mfold/rna/form1.cgi)能夠預(yù)測(cè)并給出候選miRNA前體的二級(jí)結(jié)構(gòu)和成熟的miRNA序列[22]。接著對(duì)候選的miRNA進(jìn)行人工核實(shí)，參考Meyers等判定miRNA的標(biāo)準(zhǔn)[23]，略作修改，具體如下：1)預(yù)測(cè)的野葛miRNA前體能夠折疊成發(fā)夾狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)；2)成熟的miRNA與另一條臂上的互補(bǔ)序列不超過(guò)5個(gè)堿基的錯(cuò)配；3)miRNA與另一條臂上的互補(bǔ)序列不超過(guò)3個(gè)bug；4)當(dāng)兩條以上的miRNA序列同時(shí)比對(duì)上同一前體時(shí)，本研究以miRBase中大豆Glycinemax或者苜蓿Medicagotruncatula同家族miRNA的序列作為參照。

2.4 莖-環(huán)PCR驗(yàn)證miRNA的真實(shí)性

用天根公司多糖多酚植物miRNA提取分離試劑盒(DP504)提取植物總RNA，具體操作參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取野葛幼苗根的總RNA，并使用Nano DropTM2000分光光度計(jì)和1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度、純度和完整性。

miRNA的檢測(cè)采用莖-環(huán)PCR法。隨機(jī)選取7條miRNA，分別設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄莖-環(huán)引物及PCR引物(見(jiàn)表1)，利用熒光定量PCR法驗(yàn)證miRNA的真實(shí)性。

2.4.1 第一鏈反轉(zhuǎn)錄 首先配制無(wú)RNA混合物，將4 μL 2.5 mmol·L-1dNTP、7.75 μL ddH2O、1 μL RT引物(1 μmol·L-1)在65 ℃放置5 min，接著迅速冰置2 min，接著添加4 μL 5x First-Strand緩沖液，2 μL 0.1 mol·L-1DTT，0.25 μL M-MLV(200單位/μL)，1 μL RNA模板，然后執(zhí)行反轉(zhuǎn)錄程序：16 ℃ 30 min，60個(gè)循環(huán)的30 ℃ 30 s，42 ℃ 30 s，50 ℃ 1 s，75 ℃ 5 min，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為熒光定量PCR的模板。

表1 miRNA反轉(zhuǎn)錄莖-環(huán)引物及PCR引物

2.4.2 熒光定量PCR 在PCR管中加入：10 μL 2x SYBR Premix Ex Taq II(TaKaRa，Japan)，1 μL通用反向引物(5 μmol·L-1)，1 μL miRNA特異的正向引物(5 μmol·L-1)，1 μL 上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，7 μL H2O。使用Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)C1000熱循環(huán)儀(Bio-Rad，USA)進(jìn)行擴(kuò)增。程序如下：94 ℃ 2 min，95 ℃ 20 s，45個(gè)循環(huán)94 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 6 s。

2.5 野葛miRNA的靶基因預(yù)測(cè)

使用在線軟件psRNATarget[24]，采用默認(rèn)參數(shù)對(duì)野葛miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，通過(guò)罰分機(jī)制篩選潛在靶基因，規(guī)則為：U與G配對(duì)罰0.5分，其他不匹配罰1分；小于3個(gè)堿基插入或缺失罰2分，3個(gè)堿基及以上罰3分。為了保證靶基因的真實(shí)性，本研究選擇罰分≤3的結(jié)果作為miRNA的潛在靶基因。

3 結(jié)果與分析

3.1 野葛miRNA預(yù)測(cè)結(jié)果及其二級(jí)結(jié)構(gòu)

使用psRobot軟件“psRobot-mir”模塊共篩選出27條候選miRNA前體，手工核實(shí)發(fā)現(xiàn)符合標(biāo)準(zhǔn)的共有25條，其中有9條前體產(chǎn)生2條miRNA，其余分別產(chǎn)生1條miRNA。最終在野葛中共預(yù)測(cè)出34條miRNA，它們屬于18個(gè)家族。這些miRNA的長(zhǎng)度范圍為19～24 bp，見(jiàn)表2。

表2 野葛中預(yù)測(cè)的miRNA

續(xù)表2

注：*表示最小自由能折疊指數(shù)。

通常情況下，植物miRNA前體在長(zhǎng)度和二級(jí)結(jié)構(gòu)上存在多樣性[25]。在篩選過(guò)程中，筆者發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的野葛miRNA前體的長(zhǎng)度變化相對(duì)較大，在90～203 bp；雖然其前體的長(zhǎng)度和二級(jí)結(jié)構(gòu)變化較大，但都能折疊成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1)。

預(yù)測(cè)出的25條野葛miRNA前體的MFEI值范圍為0.64～1.20，平均為0.97(見(jiàn)表2)，其中大多數(shù)符合miRNA前體二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性要求(MFEI大于0.8)[26]。

3.2 野葛miRNA真實(shí)性驗(yàn)證

為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)的miRNA真實(shí)性，本研究隨機(jī)選取7條miRNA，通過(guò)莖-環(huán)實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果顯示這7條miRNA熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線均為單峰。隨后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，均出現(xiàn)明顯單一條帶，大小約為60 bp(見(jiàn)圖2)，與預(yù)期莖-環(huán)PCR擴(kuò)增的大小相一致，從而驗(yàn)證這些miRNA的真實(shí)性。

圖1 部分野葛miRNA前體二級(jí)結(jié)構(gòu)圖

注：M.50 bp DNA Maker(a.100 bp、b.50 bp)；1.miR156c-5p；2.miR166-5p；3.miR167-5p；4.miR168-3p；5.miR396b-5p；6.miR1507-3p；7.miR2089a/b-3p。圖2 miRNA莖-環(huán)引物PCR產(chǎn)物電泳圖

3.3 野葛miRNA靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果及主要功能分析

根據(jù)預(yù)測(cè)出的34條野葛miRNA序列，通過(guò)在線psRNATarget軟件預(yù)測(cè)出235個(gè)靶基因，其中有66個(gè)有明確的功能，見(jiàn)表3。這些靶基因中有28個(gè)是抗病蛋白，其余則主要參與了野葛體內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、物質(zhì)運(yùn)輸、防御反應(yīng)等多種生物學(xué)過(guò)程。在這66個(gè)有明確功能的靶基因中，有的在不同科植物間高度保守，例如受miR156調(diào)控的SPL基因，其廣泛存在于許多科的植物中，是調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要轉(zhuǎn)錄因子[27]；miR162靶向DCL，在多科植物中有過(guò)報(bào)道，其能夠特異性地剪切雙鏈RNA并且自身也被miRNA靶向形成反饋調(diào)節(jié)[28-30]；還有的在同科植物中保守，例如本研究發(fā)現(xiàn)在豆科植物大豆和苜蓿中都找到miRNA1507靶向含有NBS的抗性蛋白[31-32]；其余的靶基因均為非保守。

表3 野葛中預(yù)測(cè)miRNA的靶基因及其編碼蛋白

續(xù)表3

續(xù)表3

4 討論

本研究在野葛中共鑒定出34條保守miRNA，預(yù)測(cè)出66個(gè)具有明確功能的靶基因，其中28個(gè)為抗病蛋白。在植物抗病防御中，具有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)的抗病基因被用于植物抗病基因識(shí)別和分類[33]。本研究預(yù)測(cè)到野葛的大部分抗病基因也包含這個(gè)特征。在野葛同科植物大豆中有報(bào)道m(xù)iRNA負(fù)調(diào)控NBS抗病基因。在最近的研究中，哈達(dá)等在研究大豆花葉病毒病(SMV)時(shí)發(fā)現(xiàn)SMV可以通過(guò)誘導(dǎo)大豆中miR1507a、miR1507c、miR482a、miR168a和miR1515a的積累，下調(diào)NBS-LRR家族抗性基因來(lái)抑制大豆的防御反應(yīng)。在抑制上述5個(gè)miRNA表達(dá)后，SMV在大豆中的感染率有明顯下降[32]。在野葛中，miR1507-3p被發(fā)現(xiàn)是與大豆miR1507a相同的保守miRNA，且其被預(yù)測(cè)的靶基因均為抗病相關(guān)基因。而在豆科植物苜蓿中，Zhai等[34]發(fā)現(xiàn)miRNA通過(guò)產(chǎn)生反式作用干擾小RAN(siRNA)負(fù)調(diào)控NB-LRR基因。這些結(jié)果為揭示野葛抗病的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

還有研究表明，食物中的外源植物miRNA可以調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物中靶基因的表達(dá)：在稻米中發(fā)現(xiàn)含量豐富的168a，被人食用后能夠減緩低密度脂蛋白從血漿中清除的速度，從而使食用者更易得高血脂、糖尿病等代謝疾病[35]。本研究在野葛中發(fā)現(xiàn)miR1514靶向Aladin蛋白質(zhì)。目前已知編碼該蛋白的AAAS基因突變是導(dǎo)致三A綜合征的原因[36]。這一發(fā)現(xiàn)也暗示了miRNA可以跨界行使功能。

在世界范圍內(nèi)，野葛主要分布于東亞及東南亞地區(qū)；在我國(guó)除青海、西藏等少數(shù)幾個(gè)省、自治區(qū)外，大部分省、自治區(qū)都有分布[37-38]。近年來(lái)隨著野葛需求量越來(lái)越大，現(xiàn)有的野生種質(zhì)資源可能難以滿足日益增長(zhǎng)的需求。解析野葛抗病的分子機(jī)制一方面有利于野葛栽培，提高其產(chǎn)量和品質(zhì)；另一方面，野葛主要活性成分為異黃酮類、萜類、生物堿類等次生代謝產(chǎn)物。植物次生代謝及其調(diào)控是植物生長(zhǎng)或進(jìn)化過(guò)程中出現(xiàn)的對(duì)外界環(huán)境改變的適應(yīng)，包括抵御一些環(huán)境脅迫和病蟲(chóng)害。本研究預(yù)測(cè)得到的miRNA的靶基因中以抗病基因居多，關(guān)注野葛抗病基因?yàn)楹罄m(xù)深入了解野葛miRNA的生物學(xué)功能，特別是在次生代謝中的作用奠定基礎(chǔ)。

本研究采用psRobot軟件進(jìn)行了miRNA預(yù)測(cè)；以前采用BLAST或者soap程序?qū)iRNA和轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行比對(duì)，然后將比對(duì)上的轉(zhuǎn)錄組序列用二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行折疊，再根據(jù)miRNA的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選；相較于以前方法，本操作更加快捷、方便，psRobot內(nèi)置二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊軟件mfold3.5在預(yù)測(cè)miRNA時(shí)可以同時(shí)輸出前體二級(jí)結(jié)構(gòu)折疊和成熟的miRNA序列。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，測(cè)序小RNA并結(jié)合生物信息學(xué)分析已經(jīng)成為鑒定miRNA的主要手段。目前已經(jīng)在紅豆杉[39]、人參[40]等藥用植物中得到應(yīng)用。今后筆者將使用高通量測(cè)序野葛的小RNA數(shù)據(jù)，進(jìn)一步預(yù)測(cè)其特異的miRNA和siRNA，并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，使結(jié)果更加豐富可靠，為深入研究野葛中小RNA的功能奠定基礎(chǔ)。