于慶偉,秦彥昌,張百平,羅國強

空軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科(西安710038)

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最常見和惡性程度最高的原發(fā)性腫瘤[1]。膠質(zhì)瘤的預(yù)后較差，尤其是膠質(zhì)母細胞瘤，其中位存活期僅12～15月，患者術(shù)后1年和5年生存率分別為低于20%和5%[2-3]。因此，尋找特定的適合于膠質(zhì)瘤早期診斷、治療以及判斷預(yù)后的新的生物標(biāo)志物，對于探索更有效的治療方法具有重要的意義。長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA,lncRNA)，是一類長度大于200個核苷酸，無蛋白質(zhì)編碼功能的RNA[4]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，許多l(xiāng)ncRNA在很多疾病的生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用，特別是在癌癥[5]。此外，研究還觀察到lncRNA在腫瘤組織中異常表達，可作為腫瘤早期診斷、治療和預(yù)測預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物。例如，研究證實，轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄1 (MALAT1) 在肺癌組織中表達水平顯著增高，MALAT1過表達組患者的預(yù)后較差[6]。也有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ZEB1-AS1可以促進膠質(zhì)瘤的發(fā)生并可預(yù)測患者的不良預(yù)后[7]。高表達的SNHG20可預(yù)測結(jié)腸直腸癌患者的預(yù)后不佳[8]，等等。這些研究結(jié)合在一起, 為lncRNA在腫瘤發(fā)生和進展中的潛在作用提供了證據(jù)和支持。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA-POU3F3在人類的多種正常組織和腫瘤組織中均有表達[9]。在多種惡性腫瘤組織中，POU3F3表達水平會發(fā)生異常，如食管鱗狀細胞癌[10]、結(jié)直腸癌[11]、肝癌[12]、胃癌[13]、膠質(zhì)瘤[14]等。但目前關(guān)于POU3F3對膠質(zhì)瘤患者臨床預(yù)后的影響卻鮮有報道。鑒于此，為了探索POU3F3在膠質(zhì)瘤組織中的表達水平及其對膠質(zhì)瘤患者的臨床意義，本課題組分析了65例膠質(zhì)瘤患者術(shù)中切除的腫瘤組織標(biāo)本及25例正常腦組織標(biāo)本中POU3F3的表達量，對POU3F3的表達水平與患者的生存率的關(guān)系進行統(tǒng)計分析，以及探討其是否是膠質(zhì)瘤患者不良臨床預(yù)后的獨立危險因素。

對象與方法

1 研究對象 從2008年9月至2013年9月在空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科接受手術(shù)切除的患者中采集了65例膠質(zhì)瘤患者的術(shù)中切除的組織標(biāo)本，其中男性39例、女性26例，平均年齡為49.8歲；根據(jù)WHO分級：I級11例，II級15例，III級22例，IV級17例。以25例同期采集的行癲癇或外傷手術(shù)內(nèi)減壓患者的正常腦組織為對照。曾接受放射治療、化療、手術(shù)和其他抗腫瘤治療的患者除外。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的分類，通過病理檢查對膠質(zhì)瘤標(biāo)本進行疾病診斷和等級分類。腫瘤及正常標(biāo)本經(jīng)液氮快速冷凍，切除后立即保存在-80°C處。本研究經(jīng)空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。所做的工作符合規(guī)定。所有患者均獲得書面知情同意。

2 研究方法 用Trizol 法 (Invitrogen, CA, USA)從組織樣品中提取總RNA。取 1 μl上述組織總RNA,按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為Cdna,應(yīng)用 qRT-PCR法分別檢測神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織標(biāo)本中POU3F3的表達水平，內(nèi)參基因設(shè)置為GAPDH。引物及探針序列如下：POU3F3上游引物正向: 5’-AATCACTGCAATTGAAGGAAAAA-3’,下游引物反向: 5’-CCTTGTTTTCCAACCCTTAGACT-3’, GAPDH上游引物正向: 5’-TGTTGCCATCAATGACCCCTT-3’,下游引物反向: 5’-CTCCACGACGTACTCAGCG-3’。采用法2-△△ct對qRT-PCR的檢測結(jié)果進行分析，所有的實驗重復(fù)3次以上。

3 隨 訪 對參與研究的患者進行為期5年的隨訪, 隨訪為門診復(fù)診或進行電話隨訪的形式，統(tǒng)計患者從最初的手術(shù)開始到最后死亡的日期，并計算患者整體的存活率，隨訪截止時間為2018年9月。其中因意外事故或因與膠質(zhì)瘤無關(guān)的原因而死亡的患者被排除。

結(jié) 果

1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中POU3F3表達水平 采用qRT-PCR技術(shù)檢測65例膠質(zhì)瘤組織和25例正常腦組織中POU3F3的表達水平。按照 WHO(2007年)神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類的標(biāo)準(zhǔn)對選取的腫瘤組織標(biāo)本進行組織學(xué)分級：I～II級26例，III～IV級39例。檢測結(jié)果顯示，與正常腦組織相比，POU3F3在膠質(zhì)瘤組織中表現(xiàn)出較高的表達水平[正常腦組織(1.000±0.277)與膠質(zhì)瘤組織(3.164±0.307),P=0.0004)]。同時通過數(shù)據(jù)對比，POU3F3的表達水平隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增高而增高[WHO I～II級(2.427±0.309)與 WHO III～IV級(3.902±0.316)，P=0.008]，說明POU3F3的表達水平與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)(圖1)。

圖1 LncRNA-POU3F3在正常腦組織和不同級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達水平

2 POU3F3表達水平在膠質(zhì)瘤患者中的作用以及對患者預(yù)后的影響 利用 Kaplan-Meier分析法進行POU3F3表達水平與患者生存率的關(guān)系分析并進行Log-rank試驗。在65例膠質(zhì)瘤患者中, 以POU3F3在膠質(zhì)瘤組織樣本中的表達水平平均值為界值將神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者分成高POU3F3表達組(n=38)和低表達組(n=27),結(jié)果顯示POU3F3表達與膠質(zhì)瘤患者整體生存率成反比，POU3F3低表達的患者總存活率明顯高于POU3F3高表達的患者，即高水平的POU3F3表達可能預(yù)示著患者整體生存率水平的下降(P=0.029)(圖2)。

圖2 LncRNA-POU3F3高表達組和低表達組患者術(shù)后5年生存率比較

3 膠質(zhì)瘤患者臨床病理變量與生存率的單因素和多因素分析 Cox回歸分析顯示POU3F3過表達(HR=2.443, 95% CI: 1.299～4.742,P=0.015)、組織學(xué)分級(HR=2.668, 95% CI: 1.489～5.290,P=0.003)、KPS評分<80分(HR=2.703, 95% CI: 1.498～5.268,P=0.001)以及術(shù)后復(fù)發(fā)(HR=2.510, 95% CI: 1.335～5.125,P=0.008)是影響膠質(zhì)瘤預(yù)后的主要因素。此外，與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤數(shù)目等無關(guān)(P>0.05)。見表1。

表1 膠質(zhì)瘤患者臨床病理變量與生存率的單因素和多因素分析

注：KPS：卡氏行為狀態(tài)評分；HR：風(fēng)險比；CI：置信區(qū)間

討 論

到目前為止，已經(jīng)鑒定出3000個lncRNA，但是其中只有少數(shù)幾個lncRNA功能被很好地證實[15]。越來越多的研究提示某些異常表達的lncRNA可以調(diào)節(jié)腫瘤的形成和進展[16-18]。關(guān)于后一種效應(yīng)，某些lncRNA的表達已經(jīng)被證明與多種癌癥的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后有關(guān)[19-21]。因此，研究lncRNA的作用可能是一個關(guān)于致癌和抑癌研究謎題中缺失的重要片段。

膠質(zhì)瘤是一種復(fù)雜的神經(jīng)膠質(zhì)細胞的惡性腫瘤，盡管近年來基礎(chǔ)和臨床研究取得了一定的進展，但與膠質(zhì)瘤發(fā)病機制有關(guān)的分子機制以及如何改善不良預(yù)后仍存在諸多問題[22-23]。lncRNA-POU3F3屬于長鏈非編碼RNA的一種，之前的研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)lncRNA-POU3F3在多種惡性腫瘤組織中的表達水平顯著上調(diào)，是一種潛在的致癌lncRNA。例如，Li等[24]人的研究團隊發(fā)現(xiàn)，在食管鱗癌組織和細胞中，lncRNA-POU3F3表達水平明顯增高，高表達的lncRNA-POU3F3促進了食管鱗癌細胞DNA甲基化，進而影響腫瘤的進展。也有研究發(fā)現(xiàn)，與正常肝組織和正常肝細胞系相比，肝細胞癌組織和細胞系中l(wèi)ncRNA-POU3F3水平顯著升高，lncRNA-POU3F3水平與臨床分期、腫瘤大小、血管浸潤轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)；此外，lncRNA-POU3F3的高表達是肝癌患者預(yù)后的獨立因素，lncRNA-POU3F3在肝癌中作為一種致癌基因，為肝癌患者提供了一種潛在的治療策略[25]。值得注意的是，也有研究報道lncRNA-POU3F3在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。例如，研究證實lncRNA-POU3F3在膠質(zhì)瘤組織和細胞中水平上調(diào)，且與膠質(zhì)瘤的惡性程度顯著相關(guān)[26]。但目前關(guān)于膠質(zhì)瘤患者組織中POU3F3的表達水平對膠質(zhì)瘤術(shù)后患者預(yù)后的影響卻未有研究報道。

本研究檢測了膠質(zhì)瘤中POU3F3的表達水平，我們發(fā)現(xiàn)，相比較于正常腦組織，POU3F3在膠質(zhì)瘤組織中呈高水平表達，此結(jié)果與先前的文獻報道一致；與此同時，分析數(shù)據(jù)顯示POU3F3的表達水平與膠質(zhì)瘤的病理分級呈正相關(guān)，提示其可能與膠質(zhì)瘤組織的惡性程度密切相關(guān)。隨后，本課題組進一步探討了POU3F3表達與術(shù)后患者整體生存率的關(guān)系。通過隨訪分析，發(fā)現(xiàn)POU3F3在患者中的表達水平與患者預(yù)后有顯著相關(guān)性，POU3F3高表達患者術(shù)后5年生存率明顯下降，表明其可能與膠質(zhì)瘤患者的術(shù)后進展有密切關(guān)系。更重要的是, 通過Cox回歸分析提供證據(jù)表明, 高表達水平的POU3F3、高病理級別以及KPS評分<80分均是影響患者術(shù)后預(yù)后的重要原因，這提示我們POU3F3可以影響膠質(zhì)瘤的進展，可作為影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨立危險因素。

綜上所述，lncRNA-POU3F3可能在膠質(zhì)瘤進展過程中發(fā)揮重要作用，過表達的POU3F3是影響患者預(yù)后的重要指標(biāo)。本研究為膠質(zhì)瘤靶向治療提供了理論依據(jù)，POU3F3在膠質(zhì)瘤過表達導(dǎo)致的不良預(yù)后的具體作用機制，將是我們下一步實驗進行的方向。