戴 維,梁朝朝,2,3,張 力,2,3,陳先國,2,3,邰 勝,2,3,尹 玉,徐雨辰,2,3,汪 賽

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)常見惡性腫瘤，目前膀胱癌全球發(fā)病率排名第9位。2015年，全球約有541 000例膀胱癌事件，其中188 000例死亡，每59例男性中有1人在79歲之前被診斷出膀胱癌，而女性中約每239人有1人確診[1]。在我國，膀胱癌發(fā)病率排名13位，死亡率排名14位，均居于泌尿系腫瘤首位[2]。膀胱癌由于局部浸潤易轉(zhuǎn)移、術(shù)后高復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)[3],其篩查診斷、預(yù)后評估、復(fù)發(fā)監(jiān)測是治療的重要環(huán)節(jié)，針對膀胱癌的發(fā)生的發(fā)展分子機(jī)制和對診斷預(yù)后監(jiān)測新手段的研究一直是泌尿外科研究的重點(diǎn)。

TPD52L1已被認(rèn)為是一種新的乳腺癌治療靶點(diǎn)，并在多種腫瘤中檢測到其高表達(dá)。但其在泌尿系腫瘤中的表達(dá)水平和生理作用尚未見報(bào)道。該研究使用免疫組織化學(xué)(二步法)和半定量免疫反應(yīng)評分(IRS評分)量化TPD52L1在膀胱癌中的表達(dá)，評估其與臨床和病理特征的潛在關(guān)聯(lián)。根據(jù)疾病特異性生存期測試TPD52L1的表達(dá)水平對膀胱尿路上皮癌預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 病例資料回顧性分析2013～2017年安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科收治的膀胱癌患者臨床資料，納入標(biāo)準(zhǔn)：① 病理證實(shí)為膀胱尿路上皮癌；② 行根治性膀胱切除術(shù)；③ 術(shù)前未接受治療的初發(fā)膀胱癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 臨床資料不完整；② 隨訪記錄缺失；③ 合并其他惡性腫瘤。符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者共計(jì)72例，其診斷年齡為38～86歲，中位數(shù)66歲(四分位距61.25～74.00)；隨訪時間為3～44個月，中位數(shù)17個月(四分位距11.25～26.00)，其余資料特征見表1。調(diào)取患者臘塊制切片行免疫組化分析，使用癌旁組織作為對照。該研究中所有患者知情同意，標(biāo)本按照道德規(guī)范和法律標(biāo)準(zhǔn)處理并匿名。組織學(xué)分級采用WHO2004膀胱尿路上皮癌惡性程度分級系統(tǒng)，腫瘤分期采用國際抗癌聯(lián)盟(UICC)2009TNM分期法。

1.2 免疫組織化學(xué)染色

1.2.1主要試劑和儀器 膀胱癌組織切片由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科統(tǒng)一制作?？鞠涫褂蒙虾Ｒ缓憧茖W(xué)儀器有限公司的電熱鼓風(fēng)干燥箱，一抗使用武漢三鷹生物技術(shù)有限公司的TPD52L1抗體(兔抗人，編號14732-1-AP )，二抗使用北京中杉金橋公司的兔二步法試劑盒(山羊抗兔，編號PV-6001)，DAB工作液使用北京中杉金橋公司的濃縮型DAB試劑盒，黏附載玻片及顯微鏡蓋玻片均購自江蘇世泰公司。

1.2.2實(shí)驗(yàn)方法 切片經(jīng)脫蠟水化后，使用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)微波輻射行抗原修復(fù)。去除內(nèi)源性過氧化物酶方法為切片置于按 1 ∶9 配置的3%過氧化氫與甲醇溶液中室溫下反應(yīng)12 min，使用2% BSA+1% Triton+97% PBS封閉液封閉1 h，使用1% BSA將TPD52L1兔抗?jié)舛认♂屩? ∶50作為一抗工作液，置于濕盒中4 ℃過夜。二抗反應(yīng)工作液來自兔二步法試劑盒，室溫反應(yīng)1 h后，使用1 ∶20 DAB稀釋液顯色，置于顯微鏡下觀察，按出現(xiàn)陽性棕色且棕色不再增加，背景為無色的原則，根據(jù)多次實(shí)驗(yàn)結(jié)果將顯色時間統(tǒng)一定為5 s，之后放入去離子水中終止反應(yīng)。隨后經(jīng)復(fù)染脫色反藍(lán)脫水封片，封片劑為中性樹脂與二甲苯1 ∶1混合物，晾干后觀察結(jié)果。

表1 膀胱尿路上皮癌患者資料

1.3 免疫組化評分使用半定量免疫反應(yīng)評分(IRS評分)對所有免疫組織化學(xué)染色進(jìn)行評分，按染色強(qiáng)度[0(無染色反應(yīng))、1+(弱染色反應(yīng))、2+(中等染色反應(yīng))、3+(強(qiáng)染色反應(yīng))]和陽性染色細(xì)胞的百分比[0(0)、1(<10%)、2(10%～50%)、3(51%～80%)、4(>80%)]相乘得出IRS值(0～12)[4]。上述評分由兩位高年資病理醫(yī)師分別作出，總結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，評分不同個例選取了IRS評分較大的一方。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，排除2例意外死亡病例，以手術(shù)治療開始到因疾病而死亡的時間作為疾病特異性生存期(disease specific surivial，DSS)，使用ROC曲線將T分期和IRS評分各分為兩組，組間比較選用χ2或Fisher確切概率法，單因素生存分析使用Kaplan-Meier法和Log Rank檢驗(yàn)，多因素生存分析使用Cox回歸模型，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IRS評分和T分期的分組通過ROC曲線將IRS評分分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。結(jié)果顯示最佳分界點(diǎn)為7，曲線下面積為0.730，P=0.002，95%CI：0.595～0.865(圖1A)，定義IRS評分高于最佳分界點(diǎn)(7)的為高表達(dá)組，小于最佳分界點(diǎn)的為低表達(dá)組。由于總樣本量較小，腫瘤T分期分組相對過多，同樣采用ROC曲線分析，結(jié)果顯示最佳分界點(diǎn)為2.5，曲線下面積為0.871，P<0.001，95%CI：0.787～0.954(圖1B)，定義大于最佳分界點(diǎn)(2.5)的值為≥T3組(T3、T4)，小于最佳分界點(diǎn)的值為≤T2組(T0、T1、T2)，病理上體現(xiàn)為按腫瘤是否突破膀胱全層分為2組。

2.2 TPD52L1在膀胱癌中的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示94.4%的膀胱尿路上皮癌中TPD52L1呈陽性表達(dá)，而周圍正常尿路上皮細(xì)胞均呈陰性。其中IRS評分小于7的陽性為低表達(dá)組，IRS評分高于7的為高表達(dá)組，見圖2 。

2.3 TPD52L1表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性分析使用χ2檢驗(yàn)對各組資料分析，結(jié)果表明，TPD52L1的表達(dá)水平與膀胱尿路上皮癌患者的性別(P=0.054)、診斷年齡(P=0.208)、腫瘤分級(P=0.377)、腫瘤N分期(P=0.154)、腫瘤大小(P=0.944)無明顯相關(guān)性，而與腫瘤是否突破膀胱全層有明顯相關(guān)性(P=0.001)，見表2。

2.4 單因素生存分析通過Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素生存分析，潛在的混雜變量包括性別、診斷年齡、TNM分期、腫瘤病理分級和腫瘤大小，結(jié)果顯示在膀胱癌中，膀胱尿路上皮癌特異性生存率與TPD52L1表達(dá)強(qiáng)度(P=0.001，Log Rank檢驗(yàn))、腫瘤是否突破膀胱全層(P<0.001)、N分期(P<0.001)、病理分級(P=0.020)有明顯相關(guān)性，而診斷年齡(P=0.332)、性別(P=0.376)、腫瘤大小(P=0.294)無明顯相關(guān)性，生存函數(shù)見圖3。

圖1 ROC曲線圖

圖2 膀胱尿路上皮癌及癌旁正常組織中的TPD52L1表達(dá) ×100

A：左側(cè)為TPD52L1低表達(dá)的膀胱尿路上皮癌細(xì)胞，右側(cè)可見呈陰性的部分正常尿路上皮細(xì)胞；B：視野內(nèi)大量高表達(dá)TPD52L1的膀胱尿路上皮癌細(xì)胞，右上方有部分呈陰性的正常尿路上皮細(xì)胞

2.5 多因素生存分析目前公認(rèn)的非肌層浸潤性膀胱癌預(yù)后主要危險因素包括高病理分期、高級別尿路上皮癌、≥3 cm的腫瘤、腫瘤數(shù)量≥8個、復(fù)發(fā)頻率大于1次/年和伴隨原位癌；肌層浸潤性膀胱癌預(yù)后主要危險因素是腫瘤浸潤深度和淋巴結(jié)情況。根據(jù)單因素分析結(jié)果，使用Cox回歸進(jìn)行多因素生存分析，見表3。

表2 臨床病理特征的χ2檢驗(yàn)結(jié)果[n(%)]

圖3 TPD52L1高、低表達(dá)組的DSS生存曲線

3 討論

TPD52L1分子是腫瘤蛋白家族D52(tumor protein D52,TPD52)的成員之一，該家族蛋白特征結(jié)構(gòu)是N端具有相類似的雙股卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，成員包括TPD52(又稱D52、PrLZ、PC-1)、TPD52L1(TPD53、D53)、TPD52L2(TPD54、D54)和TPD52L3(TPD55、D55)。第1個D52樣基因被鑒定已過了二十多年，其表達(dá)的同名蛋白家族成員間可以相互作用[5]，功能涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和囊泡運(yùn)輸。其中研究最多的是D52，早期研究[6]顯示D52最常見的生理作用是調(diào)節(jié)囊泡運(yùn)輸和外部細(xì)胞分泌,通過響應(yīng)胃壁或胰腺腺泡細(xì)胞的分泌刺激而磷酸化。研究表明其在多種癌組織中過表達(dá)如乳腺癌[7]、卵巢癌[8]、結(jié)直腸癌[9]、前列腺癌等。D52在前列腺癌中研究較多，結(jié)果顯示其可顯著降低前列腺癌細(xì)胞G0/G1 比例并增加S期細(xì)胞比例，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程；抑制雷帕霉素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬(可能是通過顯著促進(jìn)PI3K家族激酶mTOR蛋白下游分子4E-BP1水平升高及對細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié))；通過wnt/beta-catenin途徑促進(jìn)c-myc基因在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)，并促進(jìn)前列腺癌向激素抵抗型進(jìn)展；通過磷酸化Akt/Stat3并上調(diào)Bcl-2表達(dá)，抑制低雄激素水平誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞凋亡過程，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展為激素難治性前列腺癌[10]。最新研究顯示在鼻咽癌[11]和宮頸癌[12]細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)中抑制TPD52可抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

表3 DSS的多因素生存分析

關(guān)于TPD52L1的研究較少，這種TPD52樣蛋白是卷曲螺旋基序蛋白，首先通過其在人乳腺癌中的表達(dá)被鑒定出來，在結(jié)腸癌、卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)強(qiáng)烈，被認(rèn)為代表信號中間體和囊泡運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)劑。TPD52L1可與其他TPD52家族成員形成同源二聚體或異二聚體[5]，并參與細(xì)胞增殖和鈣信號傳導(dǎo)。有報(bào)道稱其在體外增加了突觸融合蛋白1和VAMP2蛋白之間的相互作用，而最重要的研究結(jié)果顯示其在乳腺癌中高表達(dá)并被認(rèn)為是乳腺癌細(xì)胞中的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白，TPD52L1的表達(dá)在乳腺癌細(xì)胞的G2-M轉(zhuǎn)換時特異性地顯著上調(diào)，并且在G2至早前期的細(xì)胞中達(dá)到最大值，這與細(xì)胞周期蛋白B1表達(dá)呈平行關(guān)系，而其在中期降至幾乎間期水平，并且其表達(dá)在轉(zhuǎn)錄后和翻譯后水平均受到調(diào)節(jié)，這表明TPD52L1表達(dá)在有絲分裂期間受到嚴(yán)格調(diào)節(jié)。此外，富集的G2-M轉(zhuǎn)換細(xì)胞顯示TPD52L1和14-3-3之間的相互作用增加，這是一種負(fù)調(diào)節(jié)G2-M轉(zhuǎn)換的銜接蛋白[13-14]?？紤]TPD52L1作為與D52結(jié)構(gòu)相似且可互相作用的蛋白家族成員，其在泌尿生殖系腫瘤中或存在高表達(dá)情況，本研究選用膀胱癌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過二步法免疫組化檢測到94.4%的膀胱尿路上皮癌中有TPD52L1的表達(dá)，而周圍正常尿路上皮細(xì)胞普遍呈陰性，隨后行IRS評分并用ROC曲線分為高、低表達(dá)組，使用χ2檢驗(yàn)分析各組資料顯示TPD52L1表達(dá)水平與腫瘤是否突破膀胱全層相關(guān)，之后本研究用單因素生存分析顯示膀胱尿路上皮癌的特異性生存率與TPD52L1的表達(dá)強(qiáng)度有明顯相關(guān)性，研究最后通過根據(jù)多因素生存分析證實(shí)了TPD52L1的高表達(dá)與腫瘤突破膀胱全層、已有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級為高級別一樣可作為膀胱尿路上皮癌預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險因子，而后三者是公認(rèn)的膀胱癌預(yù)后主要危險因素。

總之，本研究顯示膀胱尿路上皮癌組織中TPD52L1的表達(dá)明顯高于正常膀胱尿路上皮組織中的表達(dá)，其表達(dá)水平的高低與癌組織是否突破膀胱全層相關(guān)，并且隨著其表達(dá)水平的增高，其疾病特異性死亡率上升。本實(shí)驗(yàn)研究價值主要在于:① TPD52L1作為膀胱尿路上皮癌預(yù)后的獨(dú)立危險因素，有望成為新的膀胱癌預(yù)后標(biāo)志；② 術(shù)前活檢若發(fā)現(xiàn)為高表達(dá)TPD52L1的膀胱尿路上皮癌，提示腫瘤很大可能已突破膀胱全層。本實(shí)驗(yàn)不足之處在于總樣本數(shù)較少，其臨床作用需待進(jìn)一步驗(yàn)證。