李佩春， 羅南， 李曉捷

眾多的病理解剖研究證實(shí)大多數(shù)的未成熟兒伴隨著損害擴(kuò)散可最終發(fā)展成為腦白質(zhì)的萎縮和巨腦室，還有一部分的臨床后遺癥是囊腔的形成和代償?shù)纳窠?jīng)膠質(zhì)過多癥等，對(duì)于其中構(gòu)成白質(zhì)主要成分的有髓神經(jīng)纖維的結(jié)構(gòu)和功能的改變將是導(dǎo)致神經(jīng)學(xué)異常及腦性癱瘓的主要病理學(xué)基礎(chǔ)[1-2]。如何解決中樞神經(jīng)纖維的損傷后再生，一直是近些年來神經(jīng)科學(xué)方面的熱點(diǎn)之一。而體視學(xué)作為一種新型形態(tài)學(xué)三維計(jì)量工具，能更好闡述神經(jīng)超微解剖結(jié)構(gòu)的變化[3-5]，目前對(duì)小兒腦損傷中白質(zhì)損傷有髓神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的定量研究還沒有相關(guān)報(bào)道。本研究應(yīng)用體視學(xué)技術(shù)探討早期干預(yù)及康復(fù)訓(xùn)練對(duì)宮內(nèi)感染致腦損傷仔鼠腦白質(zhì)有髓神經(jīng)纖維總體積的影響，來揭示其促進(jìn)腦損傷患者運(yùn)動(dòng)功能康復(fù)的病理學(xué)機(jī)制，為臨床早期積極的應(yīng)用環(huán)境康復(fù)療法治療發(fā)育期腦損傷提供基礎(chǔ)理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 清潔級(jí)Wistar大鼠75只，雌雄比例2∶1，雌性體質(zhì)量230～260 g，雄性260～300 g，由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；脂多糖(脂多糖血清型055：B5美國Sigma公司)；鋨酸(佳木斯電鏡中心購于英國)；透射電鏡(日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備與分組 于17時(shí)將Wistar大鼠以2∶1合籠，次日上午8時(shí)查陰道涂片，以查得精子為妊娠第0天，孕鼠另籠飼養(yǎng)。將受孕的36只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組6只和脂多糖組30只。給孕第17天的脂多糖組孕鼠脂多糖450 μg/(kg·d)，連續(xù)2 d腹腔注射，而對(duì)照組孕鼠腹腔注射同劑量的生理鹽水。孕22 d前分娩的仔鼠為早產(chǎn)鼠。兩組均去除早產(chǎn)鼠。仔鼠出生后，取胎盤做蘇木精-伊紅染色觀察宮內(nèi)感染情況。判斷標(biāo)準(zhǔn)為大量中性粒細(xì)胞浸潤。隨機(jī)選取對(duì)照組仔鼠6只為生理鹽水組，選取脂多糖組仔鼠12只分為干預(yù)組和非干預(yù)組各6只。3組仔鼠均于恒溫恒濕環(huán)境中，母乳喂養(yǎng)。

1.2.2 行為療法干預(yù) (1)早期觸摸：將2日齡干預(yù)組仔鼠托至掌心，用毛刷從頭到尾勻速有力刷動(dòng)，每次持續(xù)15 min，每日1次，同時(shí)給予聲音和燈光刺激，干預(yù)至14日齡。(2)豐富環(huán)境刺激：將7日齡干預(yù)組仔鼠每日暴露于豐富環(huán)境中2 h，每日1次。60 cm×45 cm×45 cm籠內(nèi)放置不同顏色及形狀的物體，包括轉(zhuǎn)盤、管道、階梯、搖鈴、秋千、水面等，每周將環(huán)境改變2次，以造成新異刺激，干預(yù)至28日齡。非干預(yù)組、生理鹽水組分別飼養(yǎng)于20 cm×30 cm×45 cm標(biāo)準(zhǔn)籠內(nèi)，不予干預(yù)。(3)康復(fù)訓(xùn)練：將15日齡至4周齡干預(yù)組仔鼠進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練，每日1次。訓(xùn)練方法:①跑籠訓(xùn)練:采用圓形轉(zhuǎn)籠訓(xùn)練器材，轉(zhuǎn)籠直徑25 cm，內(nèi)徑5 cm，底座有一固定架，跑籠訓(xùn)練可訓(xùn)練大鼠的抓握、行走、奔跑等運(yùn)動(dòng)，每次10 min；②轉(zhuǎn)棒訓(xùn)練:一根長150 cm，直徑4.5 cm的轉(zhuǎn)棒；中點(diǎn)固定于3 r/min轉(zhuǎn)動(dòng)器上，順、逆時(shí)針交替轉(zhuǎn)動(dòng)，每次10 min；③平衡木訓(xùn)練:平衡木長170 cm，寬2 cm，平放距地面7 cm處，每次10 min。可訓(xùn)練平衡功能。

1.2.3 體視學(xué)方法 (1)心灌流固定經(jīng)4%的水合氯醛腹腔麻醉后，用2%的多聚甲醛和2.5%的戊二醛混合固定液(pH 7.4)進(jìn)行心灌流固定。去除頭骨、小腦、腦干，剪斷顱神經(jīng)后將大腦完整取出。(2)用6%的瓊脂分別包埋左右大腦半球，待瓊脂凝固后，將大腦半球沿冠狀線切成1 mm厚的連續(xù)等距切片，隨機(jī)抽取每只仔鼠大腦一側(cè)半球，在抽取出的每個(gè)大腦半球中，每3張大腦切片抽取1張。(3)在抽取出的大腦組織薄片上隨機(jī)疊放等距測點(diǎn)框，在解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)所有落在白質(zhì)斷面上的測點(diǎn)，根據(jù)卡瓦列里原理計(jì)算出整個(gè)大腦白質(zhì)的總體積。V(wm)=t×a(p)×∑p(wm)，式中V(wm)代表白質(zhì)的總體積，a(p)為每一測點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的面積(0.25 mm2)，t為切片厚度1 mm，∑p(wm)所有的與白質(zhì)重疊的計(jì)數(shù)。(4)在測點(diǎn)擊中白質(zhì)的地方抽取白質(zhì)組織塊，這樣可以保證每個(gè)部位抽中的概率都相等，平均每個(gè)大腦半球抽取3個(gè)白質(zhì)組織塊，用球切法包埋組織塊以保證各個(gè)方向分布的神經(jīng)纖維都有相同的抽樣概率，再用前述常規(guī)電鏡包埋法包埋白質(zhì)組織塊。從包埋好的組織塊上隨機(jī)切取一張60 nm的超薄切片，隨機(jī)選擇3個(gè)視野并放大6 000倍拍照。(5)有髓神經(jīng)纖維總體積：在6 000倍放大的照片上隨機(jī)疊加具有等距測點(diǎn)的透明測點(diǎn)框，計(jì)數(shù)落在整個(gè)白質(zhì)區(qū)域內(nèi)有髓神經(jīng)纖維上的測點(diǎn)數(shù)。根據(jù)公式：V(mnf)=Vv×V(wm)計(jì)算出白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維總體積。式中V(mnf)代表有髓神經(jīng)纖維總體積，Vv為有髓神經(jīng)纖維的體積密度，而Vv=∑P(mnf)/∑P(wm)式中，∑P(mnf)為落在神經(jīng)纖維上得測點(diǎn)數(shù)，∑P(wm)為落在整個(gè)白質(zhì)內(nèi)的測點(diǎn)數(shù)和V(wm)代表白質(zhì)總體積。

1.2.4 超微標(biāo)本制作流程 (1)組織切成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，先用3%戊二醛固定2～4 h。(2)用0.1%磷酸緩沖液漂洗4 h以上，4 ℃，換5次漂洗液。分出小部分標(biāo)本備用。(3)用1%鋨酸-0.1%二甲胂酸鈉緩沖液固定2 h。(4)用緩沖液或雙蒸水漂洗5 min。(5)用50%、70%、80%、90%乙醇、90%丙酮脫水10 min，100%丙酮3次，每次10 min。(6)臨時(shí)配制環(huán)氧樹脂包埋劑，按下列濃度浸透，丙酮：包埋劑=1∶1，浸1 h。丙酮：包埋劑=1∶3過夜。(7)用新鮮包埋劑包埋，加上編號(hào)標(biāo)簽。(8)聚合：35 ℃過夜，60 ℃ 24～48 h。(9)切1～2 μm半薄切片，對(duì)照定位后，60～80 nm超薄切片。(10)切片染色：用醋酸鈾飽和水溶液染后再用枸櫞酸鉛染色。

2 結(jié)果

2.1 各組仔鼠腦白質(zhì)有髓神經(jīng)纖維總體積比較 見表1。

表1 各組仔鼠腦白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維總體積比較

注：與生理鹽水組比較，aP<0.01；與干預(yù)組比較，bP<0.01；與14 d比較，ct=-18.55，-10.76，-3.10，P<0.05。

表1結(jié)果表明，非干預(yù)組和干預(yù)組仔鼠14 d和28 d有髓神經(jīng)總體積和白質(zhì)總體積顯著低于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。非干預(yù)組仔鼠28 d有髓神經(jīng)纖維和白質(zhì)總體積顯著低于干預(yù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；干預(yù)組和非干預(yù)組仔鼠14 d有髓神經(jīng)纖維和白質(zhì)總體積比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。生理鹽水組和干預(yù)組28 d有髓神經(jīng)纖維總體積顯著高于14 d，非干預(yù)組顯著低于14 d，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組白質(zhì)有髓神經(jīng)纖維透射電鏡結(jié)果 見圖1。

圖1 各組白質(zhì)有髓神經(jīng)纖維透射電鏡觀察情況(×6 000)

3 討論

早產(chǎn)兒腦室周圍白質(zhì)軟化是指早產(chǎn)未熟兒由于某些原因?qū)е碌哪X室周圍深部白質(zhì)的缺血凝固性壞死。大量文獻(xiàn)表明，腦室周圍白質(zhì)軟化是腦損傷及腦性癱瘓的主要神經(jīng)病理改變，是影響存活患兒行為功能障礙和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的最主要原因，由于腦白質(zhì)主要由神經(jīng)纖維及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成[6-7]，故研究干預(yù)措施對(duì)有髓神經(jīng)纖維超微結(jié)構(gòu)變化是目前研究的熱點(diǎn)。

體視學(xué)的應(yīng)用使得經(jīng)典的形態(tài)學(xué)觀察發(fā)生革命性變化，摒棄傳統(tǒng)的二維視角，把二維平面還原為三維立體，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞形態(tài)從定性研究走向定量法研究質(zhì)的飛躍。Pakkenberg等[8]運(yùn)用體視學(xué)方法測定老年的腦白質(zhì)體積降低約28%，Marner等[9]在國際上首次闡述了定量研究大腦白質(zhì)有髓纖維的體視學(xué)方法。但是在先天性腦損傷病中，國內(nèi)外用體視學(xué)方法研究尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)首次用體視學(xué)方法研究宮內(nèi)感染致腦損傷的有髓神經(jīng)改變進(jìn)行了相關(guān)研究，研究結(jié)果如下：(1)生理鹽水組從生后14 d到發(fā)育的關(guān)鍵期28 d，白質(zhì)總體積從原先的52.77 mm3到82.76 mm3，其中有髓神經(jīng)纖維的總體積從原先的12.99 mm3到32.77 mm3。兩者的增長比例分別為38%和61.5%，體現(xiàn)了神經(jīng)隨著生長呈現(xiàn)出一定的大體上的發(fā)育，而且大腦白質(zhì)的變化主要由其中神經(jīng)纖維的增長引起。(2)干預(yù)組第14天白質(zhì)總體積較生理鹽水組減少24.6%而到28 d時(shí)的37.5%，有髓神經(jīng)總體積相比下降34.4%到28日齡的57.8%。(3)非干預(yù)組第14天的白質(zhì)總體積較同日齡生理鹽水組減少27%而到28 d時(shí)的60.9%，有髓神經(jīng)總體積相比下降了43.5%到28日齡的81.3%。(4)干預(yù)組較非干預(yù)組比較有髓神經(jīng)纖維總體積的增加有顯著差異。

在人類的早產(chǎn)兒腦損傷致死的尸檢報(bào)告中顯示，早期腦室周圍白質(zhì)軟化，腦白質(zhì)損傷區(qū)可見炎癥細(xì)胞在壞死區(qū)聚集現(xiàn)象，而在后期的改變主要以腦室周圍囊腔形成為特征，并囊腔周圍存在強(qiáng)烈的星型細(xì)胞增殖和纖維化。在本實(shí)驗(yàn)研究中，第14天時(shí)干預(yù)組與非干預(yù)組的白質(zhì)總體積比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而有髓神經(jīng)總體積有差異，提示腦損傷后由于白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維存在自身修復(fù)的緣故，通過側(cè)支長芽等方式促進(jìn)受損神經(jīng)再生和修復(fù)?；九c腦室周圍白質(zhì)軟化早期損傷大體標(biāo)本一致。同時(shí)在非干預(yù)組的投射電鏡中觀察到受損區(qū)存在再生修復(fù)的纖維結(jié)構(gòu)形態(tài)(修復(fù)的纖維結(jié)構(gòu)末端髓鞘較薄，而且形態(tài)不規(guī)則)，也證實(shí)了上述觀點(diǎn)。但在第28天的對(duì)比中發(fā)現(xiàn)，干預(yù)組與非干預(yù)組較同日齡的生理鹽水組相比結(jié)果分別為：有髓神經(jīng)總體積減少的程度分別為58.3%和82.2%，說明非干預(yù)組自身增生的程度有限，而且隨著發(fā)育，有髓神經(jīng)纖維的損傷將難以恢復(fù)或有加重的趨勢?？赡苁侵袠猩窠?jīng)有髓神經(jīng)纖維主要是由多個(gè)少突膠質(zhì)細(xì)胞的胞突纏繞構(gòu)成，而它可以在發(fā)育中具有纏繞髓鞘的能力，而且一直維持到成年。當(dāng)在發(fā)生急性慢性脫髓鞘病變的時(shí)候，自身修復(fù)作用能使其一定程度上代償修復(fù)。如果不及時(shí)干預(yù)治療，隨著神經(jīng)的發(fā)育，腦白質(zhì)及其內(nèi)的有髓神經(jīng)纖維的損傷程度會(huì)呈現(xiàn)上述實(shí)驗(yàn)中加重的趨勢。干預(yù)組能一定程度的促進(jìn)神經(jīng)再生，考慮主要的機(jī)制是：是由于康復(fù)訓(xùn)練改變了腦組織中的微環(huán)境，增加樹突棘分支及密度，提高損傷區(qū)皮質(zhì)突觸膜糖蛋白的表達(dá)及神經(jīng)干細(xì)胞分化及遷移能力，抑制腦缺血再灌注導(dǎo)致的X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白mRNA表達(dá)，誘導(dǎo)損傷區(qū)神經(jīng)生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子等神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，來影響大腦的再生修復(fù)，促進(jìn)神經(jīng)的可塑性。國內(nèi)對(duì)短期豐富環(huán)境刺激對(duì)老年大鼠腦白質(zhì)及白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)的影響研究中，發(fā)現(xiàn)豐富環(huán)境對(duì)有髓神經(jīng)纖維的總體積有一定的影響[10]。本研究與上述研究的結(jié)果基本一致。

由于觀察的時(shí)限較短，飼養(yǎng)食物量不同，實(shí)驗(yàn)處理時(shí)纖維等物質(zhì)的縮水率因素影響，本實(shí)驗(yàn)中只是計(jì)算出神經(jīng)纖維總體積的大體情況，而沒有把損傷中活躍增生的部分區(qū)別出來加以區(qū)別，為了研究宮內(nèi)感染對(duì)腦白質(zhì)損傷的長期影響，還需要大樣本，利用先進(jìn)的標(biāo)記技術(shù)做進(jìn)一步的測量。