王錫念，徐志善，孫欽軍，包建強(qiáng)，2，3，*

（1.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（上海），上海 201306）

膠原蛋白是人體內(nèi)分布最廣的一種物質(zhì)[1]，是細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分，在結(jié)締組織、皮膚、骨骼等部位分布廣泛[2]。膠原蛋白其分子中含有獨(dú)特的三螺旋結(jié)構(gòu)，所以具有強(qiáng)韌骨骼、保護(hù)血管、促進(jìn)新陳代謝、增強(qiáng)免疫力等多重功效[3]。廣泛應(yīng)用在食品、藥物傳輸系統(tǒng)、組織工程系統(tǒng)、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域[1]。目前，膠原蛋白的提取方法主要有熱水解法、酸法、堿法、酶解法[4]。其中，熱提取法就是用一定溫度的熱水提取，獲得水溶性膠原蛋白[5]，但是此方法提取的膠原蛋白其特有的三螺旋空間結(jié)構(gòu)已被破壞，所得到的產(chǎn)物我們一般稱(chēng)之為明膠（gelatin）；酸法提取能最大程度地保持其三股螺旋結(jié)構(gòu)，但產(chǎn)品得率較低；堿法迅速且徹底，但含羥基和巰基的氨基酸全部被破壞且產(chǎn)生消旋作用（結(jié)構(gòu)變異）[6-7]，與其它提取方法相比堿法提取的膠原蛋白含量較少；酶解法較為常見(jiàn)，但其用時(shí)較長(zhǎng)，提取率偏低。

超聲波提取技術(shù)作為一種環(huán)境無(wú)污染技術(shù)[2]，具有空化作用，可以提高介質(zhì)的傳質(zhì)速率和增強(qiáng)介質(zhì)的質(zhì)點(diǎn)運(yùn)動(dòng)，使得反應(yīng)物質(zhì)以均勻的小顆粒存在，最終使細(xì)胞組織破壁或變形，目標(biāo)分子充分溶出，使提取時(shí)間縮短、純度及提取率增加[8-9]。利用超聲波提取節(jié)能、綠色等優(yōu)點(diǎn)，輔助酶解法進(jìn)行試驗(yàn)。超聲波雙酶法的研究較少，在鮟鱇魚(yú)皮中的應(yīng)用目前還未發(fā)現(xiàn)。在沈晗等[10]對(duì)酶解醬渣蛋白的研究中，采用響應(yīng)面優(yōu)化A、B 蛋白酶酶解醬渣蛋白的條件，水解度（degree of hydrolysis，DH）分別達(dá)到 7.67%、5.47%；在優(yōu)化所得的超聲預(yù)處理?xiàng)l件下再進(jìn)行酶解，水解度分別提高至9.1%、8.54%，超聲預(yù)處理效果顯著，最終采取超聲預(yù)處理A+B 步酶解，使水解度提高至較高水平的14.2%。在李俠等[11]對(duì)超聲波-雙酶法協(xié)同提取玉米須黃酮的研究中，超聲波-雙酶法協(xié)同提取玉米須黃酮提取率為（0.86±0.02）%，較單一超聲波提取 [提取率（0.72±0.02）%]有明顯提高。綜上，超聲波輔助雙酶法提取的效果較為顯著。

本研究擬以鮟鱇魚(yú)加工的下腳料魚(yú)皮為原料，采用超聲波輔助雙酶法（風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶）和雙酶法（風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶）提取鮟鱇魚(yú)皮中膠原蛋白，對(duì)兩種方法提取的膠原蛋白提取率進(jìn)行比較，旨在得出更好的提取方法，以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮟鱇魚(yú)：舟山興業(yè)有限公司；堿性蛋白酶（200 U/mg）、風(fēng)味蛋白酶（20 000 U/g）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀：源葉生物科技有限公司；牛血清：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，試驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

T6 新世紀(jì)型紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；歌能牌超聲波清洗機(jī)、DHG-9070A 型鼓風(fēng)干燥箱：上海鰲珍儀器制造有限公司；FOSS8400型全自動(dòng)凱氏定氮儀：上海瑞玢國(guó)際貿(mào)易有限公司；Seven2Go 型 pH 計(jì)、ME204 型分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DK-S28 型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；H1850R 型高速冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魚(yú)皮制備

取出冷凍鮟鱇魚(yú)→流水化凍→將魚(yú)皮剝下→分切成塊→10%異丙醇浸泡24 h 去除脂肪，清水沖洗→10 %氯化鈉溶液浸泡24 h 去除可溶性的非膠原蛋白[12]→清水沖洗→放入-50 ℃的冰箱備用。

1.3.2 魚(yú)皮膠原蛋白的提取

取鮟鱇魚(yú)皮流水解凍稱(chēng)取→加入定量提取溶劑、定量酶→超聲→恒溫水浴鍋酶解→滅酶、冷卻、離心→取上清液測(cè)鮟鱇魚(yú)皮膠原蛋白提取率

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 料液比單因素試驗(yàn)

以鮟鱇魚(yú)皮膠原蛋白提取率為指標(biāo)，采用超聲-雙酶法（風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶）提取和雙酶法提取進(jìn)行對(duì)比，控制料液比為（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL），超聲時(shí)間 60 min，pH7.5，酶解溫度 45 ℃，酶解時(shí)間4 h，風(fēng)味蛋白酶添加量4 000 U/g，堿性蛋白酶添加量4 000 U/g 進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)取均值。

1.3.3.2 超聲時(shí)間單因素試驗(yàn)

以鮟鱇魚(yú)皮膠原蛋白提取率為指標(biāo)，采用超聲-雙酶法（風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶）提取，控制料液比為 1∶15（g/mL），超聲時(shí)間（40、50、60、70、80 min），pH7.5，酶解溫度45 ℃，酶解時(shí)間4 h，風(fēng)味蛋白酶添加量4 000 U/g，堿性蛋白酶添加量4 000 U/g 進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)取均值。

1.3.3.3 風(fēng)味蛋白酶單因素試驗(yàn)

以鮟鱇魚(yú)皮膠原蛋白提取率為指標(biāo)，采用超聲-雙酶法（風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶）提取和雙酶法提取進(jìn)行對(duì)比，控制料液比為 1∶15（g/mL），超聲時(shí)間 60 min，pH7.5，酶解溫度45 ℃，酶解時(shí)間4 h，風(fēng)味蛋白酶添加量（2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 U/g），堿性蛋白酶添加量4 000 U/g 進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)取均值。

1.3.3.4 堿性蛋白酶單因素試驗(yàn)。

以鮟鱇魚(yú)皮膠原蛋白提取率為指標(biāo)，采用超聲-雙酶法（風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶）提取和雙酶法提取進(jìn)行對(duì)比，控制料液比為 1∶15（g/mL），超聲時(shí)間60 min，pH7.5，酶解溫度 45 ℃，酶解時(shí)間 4 h，風(fēng)味蛋白酶添加量4 000 U/g，堿性蛋白酶添加量（2 000、3 000、4 000、5 000、6 000 U/g）進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)重復(fù) 3 次，數(shù)據(jù)取均值。

1.3.3.5 酶解時(shí)間單因素試驗(yàn)

以鮟鱇魚(yú)皮膠原蛋白提取率為指標(biāo)，采用超聲-雙酶法（風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶）提取和雙酶法提取進(jìn)行對(duì)比，控制料液比為 1∶15（g/mL），超聲時(shí)間60 min，pH7.5，酶解溫度 45 ℃，酶解時(shí)間（2、3、4、5、6 h），風(fēng)味蛋白酶添加量4 000 U/g，堿性蛋白酶添加量4 000 U/g 進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)取均值。

1.3.3.6 酶解溫度單因素試驗(yàn)

以鮟鱇魚(yú)皮膠原蛋白提取率為指標(biāo)，采用超聲-雙酶法（風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶）提取和雙酶法提取進(jìn)行對(duì)比，控制料液比為1∶15（g/mL），超聲時(shí)間60 min，pH7.5，酶解溫度（35、40、45、50、55 ℃），酶解時(shí)間4 h，風(fēng)味蛋白酶添加量4 000 U/g，堿性蛋白酶添加量4 000 U/g 進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)取均值。

1.3.3.7 pH 值單因素試驗(yàn)

以鮟鱇魚(yú)皮膠原蛋白提取率為指標(biāo)，采用超聲-雙酶法（風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶）提取和雙酶法提取進(jìn)行對(duì)比，控制料液比為1∶15（g/mL），超聲時(shí)間60 min，pH（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5），酶解溫度 45 ℃，酶解時(shí)間4 h，風(fēng)味蛋白酶添加量4 000 U/g，堿性蛋白酶添加量4 000 U/g 進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)取均值。

1.3.4 正交試驗(yàn)

1.3.4.1 超聲-雙酶法正交試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上，選出以下5個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。以風(fēng)味蛋白酶添加量、堿性蛋白酶添加量、超聲時(shí)間、酶解時(shí)間和酶解溫度為考察因素，各選取4個(gè)水平，采用L16（45）試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以鮟鱇魚(yú)皮膠原蛋白提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳提取工藝，試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 超聲-雙酶法提取鮟鱇魚(yú)皮膠原蛋白因素水平表Table 1 Extraction of collagen from fish skin by ultrasonic double enzyme method

1.3.4.2 雙酶法正交試驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上，選出以下4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。以風(fēng)味蛋白酶添加量、堿性蛋白酶添加量、酶解溫度和pH 值為考察因素，各選取3個(gè)水平，采用L9（34）試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以鮟鱇魚(yú)皮膠原蛋白提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳提取工藝，試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表2。

表2 雙酶法提取鮟鱇魚(yú)皮膠原蛋白因素水平表Table 2 Extraction of collagen from fish skin by double enzyme method

1.4 膠原蛋白提取率的測(cè)定

1.4.1 水分含量的測(cè)定

鮟鱇魚(yú)皮水分含量的測(cè)定[13]：采用GB 5009.3-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》直接干燥法。

1.4.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

鮟鱇魚(yú)皮蛋白質(zhì)含量的測(cè)定[14]：采用GB 5009.5-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》凱氏定氮。

1.4.3 膠原蛋白提取率的計(jì)算

通過(guò)測(cè)定羥脯氨酸含量來(lái)計(jì)算膠原蛋白提取率，羥脯氨酸的測(cè)定參照GB/T 9695.23-2008《肉與肉制品羥脯氨酸含量測(cè)定》[15]。羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的回歸方程：y=0.224 4x-0.000 6（R2=0.999 97）。鮟鱇魚(yú)皮膠原蛋白提取率以干基表示[16]。

式中：X 為鮟鱇魚(yú)皮膠原蛋白提取率，%；w 為羥脯氨酸含量，g；11.1 為羥脯氨酸轉(zhuǎn)為膠原蛋白的系數(shù)；m為鮟鱇魚(yú)皮蛋白質(zhì)含量，g；k 為鮟鱇魚(yú)皮水分含量，%。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.5 和SPSS 24.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)膠原蛋白提取率的影響

料液比對(duì)膠原蛋白提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 料液比對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of material and liquid ratio on the extraction rate of collagen

從圖1得出，超聲-雙酶法膠原蛋白提取率高于雙酶法。對(duì)于超聲-雙酶法，料液比在1∶5（g/mL）至1∶10（g/mL）時(shí)，膠原蛋白提取率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，當(dāng)料液比在1∶10（g/mL）時(shí)膠原蛋白提取率最大，之后提取率呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明當(dāng)液料比值達(dá)到一定程度時(shí)，魚(yú)皮組織已經(jīng)達(dá)到足夠疏松狀態(tài)，繼續(xù)增大液料比值，使酶的濃度降低，其與底物不能達(dá)到最佳作用點(diǎn)；雙酶法，料液比在1∶15（g/mL）時(shí)，膠原蛋白的提取率最大。因此，超聲-雙酶法選擇料液比 1∶10（g/mL），雙酶法選擇料液比 1∶15（g/mL）。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

超聲時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響見(jiàn)圖2。

從圖2得出，超聲-雙酶法在超聲時(shí)間40 min～60 min 時(shí)，膠原蛋白提取率呈上升的趨勢(shì)，隨著超聲時(shí)間的增加，樣品的破碎程度增加，因此與酶的作用更加充分，超聲時(shí)間在60 min 時(shí)，提取率最高，超聲時(shí)間在60 min～80 min 時(shí)，提取率下降，這是因?yàn)槌^(guò)時(shí)間越長(zhǎng)，可能會(huì)使提取樣品溶液的溫度升高，使得酶的活力降低甚至失活，并且部分膠原蛋白分子結(jié)構(gòu)可能被破壞或者發(fā)生熱降解，使膠原蛋白提取率下降[17]，因此，選擇超聲時(shí)間60 min。

2.1.3 風(fēng)味蛋白酶添加量對(duì)膠原蛋白提取率的影響

風(fēng)味蛋白酶添加量對(duì)膠原蛋白提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.2 The effect of ultrasonic time on the extraction rate of collagen

圖3 風(fēng)味蛋白酶添加量對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of flavor protease addition on extraction rate of collagen protein

如圖3得出，超聲-雙酶法膠原蛋白提取率高于雙酶法。風(fēng)味蛋白酶添加量在2 000 U/g～4 000 U/g 時(shí)，超聲-雙酶法和雙酶法膠原蛋白提取率增加，在4 000 U/g時(shí)，膠原蛋白提取率最大，在4 000 U/g～6 000 U/g 時(shí)，膠原蛋白提取率下降。隨著酶添加量的增多，反應(yīng)速率加快，當(dāng)酶的添加量到一定濃度時(shí)，反應(yīng)速率不變，說(shuō)明酶與底物反應(yīng)充分，此時(shí)反應(yīng)速率與酶添加量無(wú)關(guān)，產(chǎn)物濃度的增大對(duì)提取率會(huì)有一定的抑制作用[17]。因此，選擇風(fēng)味蛋白酶添加量為4 000 U/g。

2.1.4 堿性蛋白酶添加量對(duì)膠原蛋白提取率的影響

堿性蛋白酶添加量對(duì)膠原蛋白提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 堿性蛋白酶添加量對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of alkaline protease addition on extraction rate of collagen protein

如圖4得出，超聲-雙酶法膠原蛋白提取率高于雙酶法。在超聲時(shí)間60 min，pH7.5，酶解溫度45 ℃，酶解時(shí)間4 h，風(fēng)味蛋白酶添加量4 000 U/g，堿性蛋白酶添加量在2 000 U/g～4 000 U/g 時(shí)，超聲-雙酶法和雙酶法膠原蛋白提取率增加，在4 000 U/g 時(shí)，膠原蛋白提取率最大，4 000 U/g～6 000 U/g 時(shí)，膠原蛋白提取率下降。隨著堿性蛋白酶添加量的增加，反應(yīng)速率加快，底物質(zhì)量濃度進(jìn)一步增大，酶的活性中心逐漸被底物所飽和時(shí)，增加底物質(zhì)量濃度提取率也不會(huì)增加，反而影響反應(yīng)速度，使提取率降低[18]。因此，選擇堿性蛋白酶添加量4 000 U/g。

2.1.5 酶解時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響

酶解時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 酶解時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.5 The effect of enzymolysis time on the extraction rate of collagen

如圖5得出，超聲-雙酶法的膠原蛋白提取率高于雙酶法。隨著酶解時(shí)間的增加，膠原蛋白的提取率也隨之增加，超聲-雙酶法在5 h 時(shí)提取率最高，在5 h以后提取率下降，而雙酶法在4 h 時(shí)提取率最高，在4 h 以后提取率下降。隨著時(shí)間的增加酶與底物的反應(yīng)速率也隨之加快，使提取率增加，在一個(gè)最適的酶解時(shí)間使提取率最高，超過(guò)最適酶解時(shí)間后，部分膠原蛋白水解，提取率下降[17]。因此，超聲-雙酶法選擇酶解時(shí)間5 h，雙酶法選擇酶解時(shí)間4 h。

2.1.6 酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響

酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響見(jiàn)圖6。

圖6 酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.6 The effect of enzymolysis temperature on the extraction rate of collagen

如圖6得出，超聲-雙酶法的膠原蛋白提取率高于雙酶法。隨著酶解溫度升高，膠原蛋白提取率升高，超聲-雙酶法在酶解溫度45 ℃時(shí)提取率最大，在45 ℃之后提取率下降，而雙酶法在50 ℃時(shí)提取率最高，在50 ℃之后提取率下降。隨著溫度的升高酶的最適溫度逐漸達(dá)到，使提取率升高，當(dāng)達(dá)到最適溫度并且酶與底物作用完全時(shí)提取率最大，之后溫度繼續(xù)升高，使酶的活力降低提取率開(kāi)始下降。在超聲的作用下，使得反應(yīng)物質(zhì)以均勻的小顆粒存在，與酶反應(yīng)更快且充分[8]，所以超聲-雙酶法在比雙酶法更低的溫度下使膠原蛋白提取率達(dá)到最大。因此，超聲-雙酶法選擇酶解溫度45 ℃。

2.1.7 pH 值對(duì)膠原蛋白提取率的影響

pH 值對(duì)膠原蛋白提取率的影響見(jiàn)圖7。

圖7 pH值對(duì)膠原蛋白提取率的影響Fig.7 Effect of pH on collagen extraction rate

如圖7得出，超聲-雙酶法的膠原蛋白提取率高于雙酶法。隨著pH 值的增大，膠原蛋白提取率增大，超聲-雙酶法和雙酶法在pH7.0 時(shí)提取率最大，在pH7.0 之后提取率下降。隨著pH 值的增大提取率增大，且酶逐漸達(dá)到最適pH 值，使提取率達(dá)到最大，pH值過(guò)大后會(huì)使酶的活性降低，提取率下降。因此，超聲-雙酶法選擇pH7.0。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲-雙酶法

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果得出各因素對(duì)提取率的影響，確定正交試驗(yàn)水平，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 超聲-雙酶法提取膠原蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of ultrasonic double enzyme extraction of collagen protein

由表3得出各因素對(duì)膠原蛋白提取率影響大?。好附鉁囟龋緣A性蛋白酶添加量＞超聲時(shí)間＞風(fēng)味蛋白酶添加量＞酶解時(shí)間。最佳提取條件為：A2B4C4D3E3，即風(fēng)味蛋白酶添加量3 000 U/g，堿性蛋白酶添加量5 000 U/g，超聲時(shí)間70 min，酶解時(shí)間5 h，酶解溫度50 ℃。對(duì)所得的優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在1∶15（g/mL），風(fēng)味蛋白酶添加量3 000 U/g，堿性蛋白酶添加量5 000 U/g，超聲時(shí)間 70 min，酶解溫度 50 ℃，酶解時(shí)間 5 h，pH7.5 的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，膠原蛋白提取率為（8.86±0.64）%。超聲-雙酶法提取膠原蛋白方差分析表見(jiàn)表4。

表4 超聲-雙酶法提取膠原蛋白方差分析表Table 4 Analysis of variance of collagen extracted by ultrasonic double enzyme method

由表4超聲-雙酶法提取膠原蛋白方差分析表得出，超聲時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率差異性顯著，其余4個(gè)因素對(duì)膠原蛋白提取率差異性極顯著。

2.2.2 雙酶法

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果得出各因素對(duì)提取率的影響，確定正交試驗(yàn)水平，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 雙酶法提取膠原蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal test results of double enzyme extraction of collagen

由表5得出各因素對(duì)膠原蛋白提取率影響大?。好附鉁囟龋撅L(fēng)味蛋白酶添加量＞pH 值＞堿性蛋白酶添加量。最佳提取條件為：A3B3C3D3，即風(fēng)味蛋白酶添加量5 000 U/g，堿性蛋白酶添加量5 000 U/g，酶解溫度55 ℃，pH8.0。對(duì)所得的優(yōu)化條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，在料液比 1∶15（g/mL），風(fēng)味蛋白酶添加量 5 000 U/g，堿性蛋白酶添加量5 000 U/g，酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間4 h，pH8.0 的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，膠原蛋白提取率為（4.55±0.20）%。雙酶法提取膠原蛋白方差分析表見(jiàn)表6。

由圖6雙酶法提取膠原蛋白方差分析表得出，風(fēng)味蛋白酶添加量和酶解溫度對(duì)膠原蛋白提取率差異性顯著，酶解時(shí)間和pH 值對(duì)膠原蛋白提取率差異性不顯著。

表6 雙酶法提取膠原蛋白方差分析表Table 6 Analysis of variance of collagen extracted by double enzyme method

2.3 超聲-雙酶法與雙酶法的比較與分析

兩種提取方法的結(jié)果比較見(jiàn)表7。

表7 兩種提取方法的結(jié)果比較Table 7 Comparison of the results of two extraction methods

從表7可以得出，超聲-雙酶法提取膠原蛋白提取率為（8.86±0.64）%，雙酶法提取膠原蛋白提取率為（4.55±0.20）%。雙酶法中風(fēng)味蛋白酶添加量比超聲-雙酶法多用2 000 U/g，且雙酶法中膠原蛋白提取率比超聲-雙酶法低4.31%，也就是超聲-雙酶法的膠原蛋白提取率更高。因此，超聲-雙酶法提取膠原蛋白的效果更佳。

3 結(jié)論

采用超聲-雙酶法提取膠原蛋白并對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果顯示，影響膠原蛋白的主次因素為：酶解溫度＞堿性蛋白酶添加量＞超聲時(shí)間＞風(fēng)味蛋白酶添加量＞酶解時(shí)間。最佳提取條件為：A2B4C4D3E3，即風(fēng)味蛋白酶添加量3 000 U/g，堿性蛋白酶添加量5 000 U/g，超聲時(shí)間70 min，酶解時(shí)間5 h，酶解溫度50 ℃。在此條件下得到的膠原蛋白提取率為（8.86±0.64）%。雙酶法提取膠原蛋白的最佳提取條件為：風(fēng)味蛋白酶添加量5 000 U/g，堿性蛋白酶添加量5 000 U/g，酶解溫度55 ℃，pH8.0。在此條件下得到膠原蛋白提取率為（4.55±0.20）%。通過(guò)超聲-雙酶法與雙酶法提取膠原蛋白的最佳提取條件及膠原蛋白提取率對(duì)比，得出雙酶法中風(fēng)味蛋白酶添加量比超聲-雙酶法多用2 000 U/g，且雙酶法中膠原蛋白提取率比超聲-雙酶法低4.31%。采用超聲-雙酶法提取有利于樣品細(xì)化及提取，且效率高，說(shuō)明超聲-雙酶法提取膠原蛋白的效果更好。通過(guò)這種方式解決了廢魚(yú)皮浪費(fèi)問(wèn)題，為廢魚(yú)皮精深加工提供理論基礎(chǔ)，還為鮟鱇魚(yú)皮膠原蛋白在食品加工中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。