李洪梅， 張君紅， 黃雪， 井潔， 張湘蓮， 余明華， 石榴

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(廣西南寧 530011)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)以結(jié)腸黏膜層和黏膜下層連續(xù)性炎癥病變?yōu)橹?，通常先累及直腸，逐漸向全結(jié)腸蔓延[1]。主要以反復(fù)腹瀉、腹痛、解黏液膿血便等消化道癥狀為主，電子腸鏡檢查以結(jié)腸黏膜糜爛、潰瘍?yōu)橹?，隨著社會的不斷進步，UC患者日益增多[2]。目前治療該疾病的藥物有：糖皮質(zhì)激素、5-氨基水楊酸、免疫抑制劑、生物制劑等，其中后3種藥物治療UC療程長，易反復(fù)，且費用高。由于西藥的限制性，研發(fā)新藥或?qū)ふ姨娲幬锲仍诿冀蕖Ｑ芯勘砻?，中藥治療UC不僅不良反應(yīng)小、療效明顯，而且價格低廉。鹽酸小檗堿具有抗炎、抑菌、抗血小板聚集等作用[3]，在輔助治療該疾病有著一定的療效，且價格便宜，因此，研究該藥的作用機制，可為輔助治療UC提供新的理論基礎(chǔ)，為廣大經(jīng)濟困難的UC患者帶來希望，給社會帶來一定的價值。Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)是天然免疫受體，它可表達于腸道黏膜細胞，并參與識別炎癥產(chǎn)物及傳導(dǎo)炎癥信號[4]。許多研究證實，TLRs與UC的發(fā)病關(guān)系密切，其中，Toll樣受體2 (toll-like receptor 2， TLR2) 是重要的家族成員之一，其很少表達于正常機體，但在炎癥腸道中表達則明顯偏高[5]。TLR2能夠識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)[6]，通過激活下游信號傳導(dǎo)分子，激活核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)，導(dǎo)致炎癥因子的表達，最終引發(fā)腸道黏膜免疫反應(yīng)[7]。也有研究表明，白細胞介素-9(interleukin 9，IL-9)可參與機體的炎癥反應(yīng)，而且不同濃度的IL-9可誘導(dǎo)產(chǎn)生不同數(shù)量的炎癥因子[8]。2015年6月至2018年5月本研究探討鹽酸小檗堿的作用機制：是否具有通過調(diào)節(jié)IL-9、TLR2的表達而發(fā)揮治療潰瘍性結(jié)腸炎的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 清潔級SD大鼠40只，雌雄各半，體重180～220 g， DSS(分子量36 000～50 000)及鹽酸小檗堿、美沙拉嗪等藥品分別購買于美國MP公司及桂中大藥房。DAB試劑盒、ELISA試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、擴增試劑盒、生理鹽水分別購買于中杉金橋公司、華美公司、Thermo公司、TaKaRa公司、廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，4%多聚甲醛、水合氯醛、大便隱血測定試劑盒(干化學(xué)法)、EP管、蓋玻片等其他試劑耗材購自南寧市品勝實驗用品經(jīng)營店。人與大鼠給藥劑量的換算[9]：按照200 g大鼠用藥劑量等于70 kg人的臨床用藥劑量，大鼠的劑量=人臨床用藥劑量(mg/kg)×70 kg×0.018/200 g=6.3×人臨床用藥劑量mg/kg。重度UC患者，美沙拉嗪用量可達4 000 mg/d，換算成大鼠美沙拉嗪用量為420 mg/kg；鹽酸小檗堿成人用量為900 mg/d，換算成大鼠用量約100 mg/kg。

1.2 試驗方法

1.2.1 造模 將大鼠分為5組(n=8):正常對照組、DSS模型組、美沙拉嗪組、鹽酸小檗堿組、鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組。潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型建立參考文獻[10]，并結(jié)合2次預(yù)實驗結(jié)果，第1～7天正常對照組大鼠自由飲用蒸餾水，其余4組大鼠自由飲用蒸餾水配制的濃度為5.5%的DSS溶液，使其誘導(dǎo)形成潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型。

1.2.2 藥物干預(yù) 第8天予停止飲用DSS溶液，改飲用蒸餾水，美沙拉嗪組及鹽酸小檗堿組大鼠分別予美沙拉嗪420 mg/kg(0.2 mL/10 g wt)、鹽酸小檗堿100 mg/kg(0.2 mL/10 g wt)灌胃，聯(lián)合用藥組予美沙拉嗪420 mg/kg(0.1 mL/10 g wt)+鹽酸小檗堿100 mg/kg(0.1 mL/10g wt)聯(lián)合灌胃，而正常對照組及DSS模型組大鼠均1次/d予蒸餾水灌胃(0.2 mL/10 g wt)，連續(xù)7 d。

1.2.3 標(biāo)本采集 給予藥物灌胃治療1周后，予10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)進行腹腔麻醉，固定大鼠肢體，用酒精消毒腹部后修剪毛發(fā)，沿正中線切開腹部，逐層分離，從下腔靜脈采血，室溫靜置2 h，離心(27℃ 2 000 r/min離心10 min)后，移液槍吸取上清液，放置-80℃冰箱低溫保存。并將取下的整段結(jié)腸，用冰冷生理鹽水沖洗干凈，剪取病變明顯處的結(jié)腸組織約1 cm放入4%的甲醛溶液中固定；其余結(jié)腸組織放置-80℃冰箱低溫保存。

1.2.4 疾病活動指數(shù)(DAI)評分 參考文獻[11]的DAI評分方法，每天觀察記錄大鼠的一般情況，如體重、大便性狀、隱血、毛發(fā)光澤度、精神狀態(tài)、是否易激惹等變化，用干化學(xué)法測定各組大鼠大便出血情況。具體評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

注：DAI=(體重下降分數(shù)+大便性狀分數(shù)+大便隱血情況分數(shù))/3

1.2.5 結(jié)腸組織病理學(xué)評分 將保存在4%的甲醛溶液中的結(jié)腸組織取出做成病理切片，蘇木素-伊紅染色后，觀察病理切片，進行結(jié)腸組織病理學(xué)評分，具體評分[11]標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 結(jié)腸組織病理學(xué)評分

注：結(jié)腸組織病理學(xué)評分=炎癥評分×損傷深度評分×隱窩損傷評分×炎癥范圍(%)評分

1.2.6 檢測指標(biāo) 酶聯(lián)免疫吸附測定試驗(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測大鼠血清IL-9水平，嚴格按照試劑盒要求操作。用免疫組織化學(xué)法檢測大鼠結(jié)腸組織TLR2蛋白的表達水平，按照試劑盒要求操作，嚴格執(zhí)行。顯微鏡鏡下觀察大鼠結(jié)腸組織TLR2蛋白表達情況。每張切片選取5個棕黃色顆粒最多且互不重疊的視野，每個視野計數(shù)200個細胞，計算陽性細胞所占百分率[12]。

RT-PCR方法測定各組結(jié)腸組織TLR2 mRNA水平: (1)用Trizol方法提取RNA；(2)分光光度計檢測RNA濃度；(3)按照Thermo試劑盒的操作要求，嚴格執(zhí)行，進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA；(4)擴增：引物由TaKaRa公司合成，內(nèi)參GAPDH引物序列為：上游引物：5′-TGACCTCAACTACATGGTCTACA-3′，下游引物：5′-CTTCCCATTCTCGGCCTTG-3′。TLR-2上游引物序列(F)：5′-AGCAGGATTCCTATTGGGTGGAG-3′，下游引物序列(R)：5′-ATGATCCATTTGCCCGGAAC-3′，產(chǎn)物長度112 bp。擴增反應(yīng)體系為20 μL，其中cDNA 1 μL，下游引物0.8 μL，上游引物0.8 μL，無酶水7 μL，反應(yīng)條件：95℃，30 s；95℃，5 s ；60℃，34 s；共40個循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況比較 除正常對照組外，鹽酸小檗堿組及鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組大鼠于造模第1天即出現(xiàn)黏液便及松軟大便；造模第2天，DSS模型組大鼠出現(xiàn)松軟大便及大便潛血+，鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組可見肉眼血便；隨著DSS的自由飲用，各組大鼠陸續(xù)出現(xiàn)軟便、爛便及血便，肛周污穢，毛發(fā)晦暗凌亂，精神萎靡，體重不同程度地下降；第7天，自由飲用DSS溶液的各組大鼠DAI評分均明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；鹽酸小檗堿組、美沙拉嗪組及鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組大鼠分別予相應(yīng)藥物灌胃后，解稀爛便及解血便癥狀逐漸消失，體重呈逐漸上升趨勢，精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，毛發(fā)逐漸恢復(fù)光澤。第14天，與DSS模型組對比，鹽酸小檗堿組、美沙拉嗪組DAI評分稍降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組大鼠DAI評分明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

2.2 大鼠結(jié)腸組織肉眼觀察 正常對照組大鼠結(jié)腸皺襞紋理清晰，結(jié)構(gòu)正常，無黏膜水腫、糜爛；DSS模型組大鼠結(jié)腸組織肉眼可見黏膜充血、水腫，靠近肛門處腸壁明顯變薄，甚至可見巨結(jié)腸及糜爛、淺表潰瘍；其余3組大鼠結(jié)腸組織靠近肛門處可見腸壁明顯變薄，部分可見愈合的潰瘍瘢痕。

2.3 大鼠結(jié)腸組織病理學(xué)觀察 正常對照組大鼠結(jié)腸黏膜結(jié)構(gòu)完整、腺體排列規(guī)整；DSS模型組大鼠結(jié)腸組織腺體結(jié)構(gòu)紊亂或消失，甚至黏膜糜爛，有大量炎性細胞浸潤，杯狀細胞消失；美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織可見黏膜缺損，腺體排列不整齊，及中等量炎性細胞浸潤；鹽酸小檗堿組大鼠結(jié)腸組織腺體排列紊亂、可見炎性細胞浸潤及隱窩結(jié)構(gòu)變形，甚至萎縮；鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪大鼠結(jié)腸組織腺體結(jié)構(gòu)排列相對整齊，可見少量炎性細胞浸潤，可見到大量杯狀細胞(圖1)。與DSS模型比較，正常對照組、美沙拉嗪組、鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組大鼠組結(jié)腸組織病理學(xué)評分明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而鹽酸小檗堿組評分有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與美沙拉嗪組、鹽酸小檗堿組對比，鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組結(jié)腸組織病理學(xué)評分有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

A:正常對照組;B:DSS模型組;C:鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組;D:鹽酸小檗堿組;E:美沙拉嗪組

組別nDAI評分第7天第14天結(jié)腸組織病理學(xué)評分正常對照組80.000±0.0000.000±0.0000.440±0.315△△DSS模型組82.251±0.661?2.584±0.3465.325±1.466美沙拉嗪組82.419±0.556?1.916±0.586△2.975±1.626△△▲鹽酸小檗堿組82.333±0.618?2.041±0.517△3.703±1.861△▲鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組82.209±0.563?1.625±0.486△△1.525±1.233△△

*與正常對照組比較P<0.01; 與DSS模型組比較△P<0.05，△△P<0.01；▲與鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組比較P<0.05

2.4 酶聯(lián)免疫吸附法測定各組大鼠血清中IL-9含量 與DSS模型組對比，正常對照組、鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組大鼠血清IL-9的含量明顯偏低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，而美沙拉嗪組、鹽酸小檗堿組血清IL-9表達有所偏低(P<0.05)。見表4。

2.5 免疫組織化學(xué)法檢測各組大鼠結(jié)腸組織TLR2蛋白表達 Olympus光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理學(xué)切片，細胞質(zhì)和(或)細胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞，正常對照組、DSS模型組及其他3組藥物治療組陽性細胞表達量各不同，DSS模型組大鼠結(jié)腸黏膜、黏膜下層、黏膜肌層等細胞核及細胞質(zhì)可見到明顯棕黃顆粒，鹽酸小檗堿組、美沙拉嗪組及鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組可見到多少不等的棕黃色顆粒，而正常對照組大鼠結(jié)腸組織可見少量散在棕黃色顆粒，炎性細胞僅弱表達(圖2)。與DSS模型組比較，正常對照組、鹽酸小檗堿組、美沙拉嗪組及鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組陽性細胞表達率明顯偏低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與鹽酸小檗堿組、美沙拉嗪組比較，鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組表達量偏低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

2.6 各組大鼠結(jié)腸組織TLR2 mRNA的表達 用相對定量方法處理數(shù)據(jù)，GAPDH作為內(nèi)參基因， 結(jié)果用2-ΔΔCT值表示。相對DSS模型組，正常對照組、美沙拉嗪組、鹽酸小檗堿組及鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織TLR2 mRNA表達明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與美沙拉嗪組、鹽酸小檗堿組比較，鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組大鼠結(jié)腸組織TLR2 mRNA表達有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

A:DSS模型組;B:正常對照組;C:鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組;D:鹽酸小檗堿組;E:美沙拉嗪組

組別nIL-9TLR2正常對照組836.065±14.617??0.114±0.031??DSS模型組8229.356±99.5080.352±0.084美沙拉嗪組894.915±41.036?0.214±0.055??△鹽酸小檗堿組895.203±30.684?0.245±0.074??△鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組838.601±21.455??0.149±0.055??

與DSS模型組比較*P<0.05,**P<0.01；△與鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組比較P<0.05

組別nTLR2 mRNA正常對照組80.067±0.023?DSS模型組80.449±0.089美沙拉嗪組80.279±0.083?△鹽酸小檗堿組80.311±0.070?△鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組80.206±0.071?

*與DSS模型組比較P<0.01;△與鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組比較P<0.05

3 討論

UC發(fā)病機制尚不明確，可能與遺傳因素、環(huán)境因素、感染因素、免疫因素及個人心理因素等有關(guān)[13]。目前西醫(yī)治療該病具有規(guī)律性、快速性及高效性等優(yōu)點，但難以根治，且部分患者治療效果欠佳，易反復(fù)。研究表明，中醫(yī)中藥治療UC具有鮮明的特色，不僅能長期緩解癥狀，還可減少復(fù)發(fā)，且療效顯著[1]。

鹽酸小檗堿是黃連的主要有效成分，已經(jīng)被證實具有抗炎、抑菌、抗血小板聚集、降脂、降糖等多種作用[3]。許多研究證實，鹽酸小檗堿對UC具有較好的療效[14-16]，其可能通過調(diào)整腸道微生態(tài)環(huán)境、保護腸道結(jié)構(gòu)完整性、調(diào)節(jié)細胞或體液免疫等來發(fā)揮治療作用[17]。Feng等[18]研究發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿可以抑制環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)活性，而COX-2可催化花生四烯酸(arhaidoincacid，AA)生成前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)，過量的PGE2可導(dǎo)致黏膜通透性增加及血管擴張，使結(jié)腸組織潮紅腫脹[19]，導(dǎo)致炎癥發(fā)生。鹽酸小檗堿可能是通過抑制COX-2的活性從而使生成的前列腺類似物減少，減輕炎癥反應(yīng)，進而降低結(jié)腸炎癥活動度。鹽酸小檗堿具有顯著的抗血小板聚集作用，能抑制家兔血小板中血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)的合成，而TXA2可通過聚集血小板、收縮血管平滑肌，導(dǎo)致血管痙攣和微血栓形成，鹽酸小檗堿可能是通過抑制血漿TXA2合成，從而改善血液高凝狀態(tài)，起到治療UC的作用。因此，鹽酸小檗堿具有治療UC的功效，但其作用機制尚不明確，我們通過檢測實驗組大鼠血清IL-9、結(jié)腸組織TLR2 mRNA、TLR2蛋白的表達來研究鹽酸小檗堿治療UC的作用機制。

炎癥的發(fā)生，與機體內(nèi)促炎細胞因子及抗炎細胞因子之間的對等關(guān)系被破壞關(guān)系密切。研究表明，IL-9參與機體的變態(tài)反應(yīng)及免疫反應(yīng)[20]，也有學(xué)者認為IL-9與UC發(fā)病密切相關(guān)，但相關(guān)研究資料甚少。IL-9主要來源于Th9細胞，其中Th9細胞是新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細胞亞群的一種[21]。Nalleweg 等[22]研究發(fā)現(xiàn)IL-9參與UC的發(fā)病過程，且與疾病活動程度相關(guān)，相對正常人及輕度UC患者，重癥UC患者的IL-9水平明顯升高。腸上皮細胞上含有大量的IL-9受體，有研究用IL-9抗體中和小鼠體內(nèi)IL-9，UC小鼠炎癥指標(biāo)下降，消化道癥狀及結(jié)腸組織病理變化改善[21, 23-24]，此研究結(jié)果支持IL-9參與UC發(fā)病的觀點。IL-9是通過緊密連接分子改變結(jié)腸組織屏障性質(zhì)來參與炎癥反應(yīng)，使構(gòu)成緊密連接的結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生變化，導(dǎo)致腸道黏膜通透性增加，腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂，炎癥反應(yīng)擴大，最終影響結(jié)腸組織潰瘍的愈合[25-26]。此外，研究表明，低濃度的IL-9可起到增強原代巨噬細胞對PAMPs的誘導(dǎo)作用，導(dǎo)致炎癥因子的產(chǎn)生，而在高濃度IL-9的作用下，同樣可致使原代巨噬細胞產(chǎn)生炎癥因子，由此說明，IL-9參與巨噬細胞PAMPs激活信號的傳導(dǎo)[8]。

作為炎性反應(yīng)鏈的啟動蛋白，TLR2主要表達于Th1細胞、Th2細胞、巨噬細胞、單核細胞及部分腸道黏膜細胞等，可識別革蘭陽性菌的肽聚糖、磷壁酸等。研究發(fā)現(xiàn)UC模型組大鼠結(jié)腸組織TLR2基因及TLR2蛋白的表達水平明顯偏高，予藥物干預(yù)治療后，大鼠體內(nèi)的TLR2基因及TLR2蛋白的表達水平降低，消化道癥狀緩解，炎癥評分下降，考慮TLR2在對腸道PAMPs進行模式識別的過程中，可觸發(fā)對NF-κB的激活，過量的TLR2會大規(guī)模激活NF-κB，使得炎性因子過度表達，導(dǎo)致炎癥的擴大發(fā)生。也有研究表明，激活的NF-κB又可促進 TLR2的表達，形成 TLR2 -NF-κB-TLR2循環(huán)，從而產(chǎn)生持續(xù)擴大的炎癥反應(yīng)[27-29]。TLR2/NF-κB通路的闡明，表明 TLR2在UC發(fā)展中占有重要地位。

本研究采用DSS誘導(dǎo)建立UC大鼠模型，采用ELISA、免疫組織化學(xué)法、RT-PCR等方法檢測各組大鼠血清IL-9及結(jié)腸組織TLR2 mRNA、TLR2蛋白的表達水平。實驗結(jié)果表明給予美沙拉嗪、鹽酸小檗堿及鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪治療UC大鼠后，大鼠腹瀉、便血、體重下降等癥狀得到改善，毛發(fā)恢復(fù)光澤，精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)。與DSS模型組對比，鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組大鼠第14天DAI評分、結(jié)腸組織病理學(xué)評分、血清IL-9表達量明顯下降(P<0.01)，而美沙拉嗪組、鹽酸小檗堿組第14天DAI評分、血清IL-9表達量有所下降(P<0.05)；與美沙拉嗪組、鹽酸小檗堿組對比，鹽酸小檗堿聯(lián)合美沙拉嗪組結(jié)腸組織病理學(xué)評分、血清IL-9、結(jié)腸組織TLR2 mRNA、TLR2蛋白表達均有所下降(P<0.05)。通過本研究，猜測鹽酸小檗堿可能是通過降低UC大鼠結(jié)腸組織TLR2 mRNA、TLR2蛋白的表達來影響TLRs/NF-κB通路，以及TLR2-NF-κB-TLR2的自循環(huán)，最終減弱NF-κB的激活，減少由NF-κB引起的炎癥因子含量，減輕其造成的結(jié)腸炎癥反應(yīng)。此外，鹽酸小檗堿也可能是通過減少血清IL-9的表達，改變腸道黏膜通透性，維持腸道菌群平衡，防止炎癥反應(yīng)擴大，加快結(jié)腸損傷組織的愈合；也可能是通過減少血清IL-9的表達從而減弱對原代巨噬細胞和(或)PAMPs的誘導(dǎo)作用，從而減少炎癥因子對腸道黏膜的刺激。這可能是鹽酸小檗堿治療UC的作用機制之一。目前鹽酸小檗堿治療UC的作用機制尚未明確，仍需廣大研究者在臨床及實驗中進一步深入研究。