何澤民，孫志會(huì)，于永慧，羅聲棟，王益清，王景林，姜永強(qiáng)，宋立華

1.病原微生物生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院 微生物流行病研究所，北京100071；2.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心 臨床研究管理中心，北京 100039

貝氏柯克斯體（Coxiella burnetii）俗稱 Q 熱立克次體，為革蘭陰性專性細(xì)胞內(nèi)寄生菌。貝氏柯克斯體主要通過氣溶膠傳播，引起人類Q 熱（que?ry fever，不明熱），通常表現(xiàn)為流感樣癥狀，感染劑量可低至1 個(gè)菌體[1]。九里（Nine Mile）株是貝氏柯克斯體參考菌株，于1935年分離自美國蒙大拿州的一只安氏革蜱[2]。世界各地的實(shí)驗(yàn)室用不同培養(yǎng)方法對此參考菌進(jìn)行了長期傳代。傳統(tǒng)的貝氏柯克斯體培養(yǎng)方法包括感染動(dòng)物、雞胚培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)，直到2009年美國落基山實(shí)驗(yàn)室發(fā)明了貝氏柯克斯體無細(xì)胞培養(yǎng)方法[3-4]。

在雞胚或細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)，不同貝氏柯克斯體分離株均會(huì)發(fā)生不可逆的相變異。九里株的典型相變異是從強(qiáng)毒的Ⅰ相變異為弱毒的Crazy相[5]或無毒的Ⅱ相[6-7]。九里株的Ⅰ相、Crazy 相、Ⅱ相菌分別表達(dá)全長脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、含部分 O 抗原的 LPS、完全缺失 O 抗原的LPS[8]。與九里株Ⅰ相菌（RSA 493 克?。┑幕蚪M相比，九里株Ⅱ相菌（RSA 439 克?。┗蚪M的主要變化是有25 997 bp的刪除區(qū)，對應(yīng)20 個(gè)基因（CBU_0679～CBU_0698）的缺失[9-10]，而 Crazy 相的基因組在Ⅱ相菌刪除區(qū)基礎(chǔ)上有更多的堿基缺失[8,10]。顯然九里株的刪除區(qū)與Ⅱ相變異無明顯關(guān)聯(lián)。長期以來，九里株及其他貝氏柯克斯體分離株的相變異遺傳學(xué)機(jī)制不清楚。

九里株Ⅱ相菌的培養(yǎng)特征等與九里株Ⅰ相菌高度相似[11]，且致病力低，可以在生物安全Ⅱ級實(shí)驗(yàn)室操作[12]，在貝氏柯克斯體研究中被廣泛應(yīng)用。長期以來，研究人員用九里株Ⅱ相菌（RSA 439）開展研究，但以Ⅰ相菌（RSA 493）基因組序列為參考[14]，九里株Ⅱ相菌的基因組細(xì)微變異缺乏報(bào)道。2017年美國科學(xué)家Millar 對九里株Ⅱ相菌（RSA 439，Clone 4）進(jìn)行了測序，在刪除區(qū)基礎(chǔ)上鑒定了更多的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（single nucleotide polymorphisms，SNP）變 異[12]。 2018年Beare 等闡明了 RSA 439的相變異與 CBU_0533 變異有關(guān)[8]。我們用半固體平板克隆方法對我室保存的九里株Ⅱ相菌株進(jìn)行分離和全基因組測序分析，有助于理解貝氏柯克斯體的體外適應(yīng)性變異，也對今后采用遺傳背景均一的貝氏柯克斯體克隆開展相關(guān)基礎(chǔ)研究有參考意義。

1 材料與方法

1.1 九里株Ⅱ相菌的克隆分離與基因組提取

貝氏柯克斯體九里株Ⅱ相菌株為本室保存。利用國外已發(fā)表的平板克隆方法[4]，隨機(jī)選擇單克隆連續(xù)克隆2 次，得到CB01 克隆株，將CB01 接種到 ACCM-2 中，在 37℃、2.5% O2、5%CO2的環(huán)境中培養(yǎng)，培養(yǎng) 7 d 后 4℃、12 000 r/min離心15 min 收集菌體沉淀，用蛋白酶K 消化-酚氯仿抽提法純化基因組DNA，-20℃保存。

1.2 測序

對提取的基因組DNA 用Illumina Hiseq 2500和PacBio RSⅡ測序系統(tǒng)分別做二代和三代測序，由北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司完成。

1.2.1 PacBio 數(shù)據(jù)產(chǎn)出流程 利用Nanodrop/凝膠電泳技術(shù)檢測樣品，樣品合格后采用標(biāo)準(zhǔn)的PacBio 建庫流程構(gòu)建文庫，建好的文庫按PacBio標(biāo)準(zhǔn)文庫QC 流程進(jìn)行質(zhì)控，按PacBio 標(biāo)準(zhǔn)上級流程進(jìn)行。

1.2.2 Illumina 數(shù)據(jù)產(chǎn)出流程 利用Nanodrop 測D260nm/D280nm和凝膠電泳技術(shù)檢測樣品，樣品合格后采用標(biāo)準(zhǔn)的Illumina 建庫流程構(gòu)建文庫，建好的文庫采用AB 公司的stepONE plus QPCR 儀進(jìn)行質(zhì)檢，當(dāng)文庫檢測為單峰，且濃度高于3 nmol/L，體積大于25 μL 判定為合格，按照Illumina 標(biāo)準(zhǔn)Cluster 生成、Pooling 和定量方法進(jìn)行樣本文庫混合，并制備Cluster。

1.2.3 測序反應(yīng) 由 Bluepippin 系統(tǒng)（Sage Sci?ence 公司）生成 20 kb SMRTbell 庫，利用 PacBio RSⅡ系統(tǒng)進(jìn)行單分子實(shí)時(shí)讀長測序。

1.3 測序結(jié)果分析

對三代測序的結(jié)果進(jìn)行拼接，然后用二代測序結(jié)果清洗三代，得到全基因組序列。在Patric（https://www.patricbrc.org/）上對全基因進(jìn)行整體分析。

1.4 基因組比對

從NCBI下載RSA 439和RSA 493基因組序列及注釋（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/ge?nomes/543），用Snippy軟件（https://github.com/tseemann/snippy）將CB01序列分別與RSA 493和RSA 439的基因組序列進(jìn)行比較分析，找出SNP并對差異基因功能進(jìn)行注釋。在NCBI（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）上分別將CB01 基因組與RSA 439 基因組和RSA 493 基因組進(jìn)行比較，找到大片段差異。

2 結(jié)果

2.1 CB01全基因組測序結(jié)果

貝氏柯克斯體是專性胞內(nèi)寄生菌，但其基因組富含插入序列[14]。以插入序列IS1111 為例，該序列編碼轉(zhuǎn)座酶，其拷貝數(shù)高達(dá)56 個(gè)。由于貝氏柯克斯體基因組中重復(fù)序列多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，普及應(yīng)用的二代測序技術(shù)無法獲得完整基因組序列。為了解CB01的完整基因組結(jié)構(gòu)，首先利用PacBio 三代測序技術(shù)進(jìn)行測序并獲得完整的基因組框架。意外的是，我們發(fā)現(xiàn)該測序技術(shù)在分析貝氏柯克斯體序列中的重復(fù)堿基時(shí)易發(fā)生錯(cuò)誤的單堿基缺失。因此，又采用二代測序技術(shù)對三代測序結(jié)果進(jìn)行單堿基缺失校正。校正后的CB01 基因組全長2.024 Mb，GC 含量為42.68%，包含1 個(gè)1.987 Mb的環(huán)狀染色體和1 個(gè)37.321 kb的質(zhì)粒。染色體包含2213 個(gè)蛋白編碼區(qū)（CDS）、87 個(gè)重復(fù)區(qū)域、41 個(gè) tRNA 編碼區(qū)和 3 個(gè)rRNA 編碼區(qū)；質(zhì)粒包含54 個(gè)CDS。環(huán)狀染色體基因組模式如圖1所示。

2.2 與九里株Ⅰ相菌RSA 493基因組的比較分析

與RSA 493的基因組進(jìn)行比對，CB01 染色體上存在23 個(gè) SNP，包括14 個(gè)堿基替換（表1）、7 個(gè)堿基缺失（表2）和1 個(gè)位于基因間區(qū)的堿基插入。CBU_0533 基因中的單堿基缺失是九里株發(fā)生Ⅱ相變異并缺失O 抗原的遺傳學(xué)原因[9]。因此測序結(jié)果在遺傳學(xué)上證實(shí)了CB01 為Ⅱ相菌克隆。另外，質(zhì)粒上存在1 個(gè)同義突變（表1）。

圖1 貝氏柯克斯體九里株CB01克隆的染色體模式圖

表1 堿基替換統(tǒng)計(jì)表

表2 缺失堿基統(tǒng)計(jì)表

表3 堿基替換統(tǒng)計(jì)表

表4 堿基缺失統(tǒng)計(jì)表

2.3 與九里株Ⅱ相菌RSA 439基因組的比較分析

與RSA 439的基因組進(jìn)行比對，CB01 存在6個(gè)SNP，包括4 個(gè)堿基替換（表3）和2 個(gè)堿基缺失（表4）。CB01的質(zhì)粒與Ⅰ相 RSA 493 相比有 1 個(gè)同義SNP，與Ⅱ相菌RSA 439 相比有2 個(gè)非同義SNP 差異和1 個(gè)同義SNP。測序結(jié)果說明CB01的適應(yīng)性生長更大的可能性與染色體變異有關(guān)，而國外Ⅱ相菌RSA 439的體外適應(yīng)性生長可能同時(shí)與染色體和質(zhì)粒變異相關(guān)。

2.4 大片段差異

與九里株Ⅰ相菌RSA 493的基因組相比，CB01 基因組有一段刪除序列，大小為25 997 bp，對應(yīng) RSA 493 基因組的 620 667～646 663 堿基，導(dǎo)致 CBU_0679～CBU_0698 基因缺失。CB01 基因組上還存在5 個(gè)重復(fù)序列，大小分別為1562、4998、4117、3351 和 3831 bp，共包含 20 個(gè)基因。與九里株Ⅱ相菌RSA 439 相比，CB01 同樣多出這5 個(gè)重復(fù)序列。

3 討論

貝氏柯克斯體九里株自1935年被首次培養(yǎng)后在國際上廣泛流傳，是貝氏柯克斯體研究用參考菌株。我國的九里株引自前蘇聯(lián)。由于培養(yǎng)困難，易發(fā)生交叉污染等原因，有必要對研究用菌株進(jìn)行遺傳學(xué)鑒定。我們利用高通量測序技術(shù)完成了貝氏柯克斯體九里株CB01 克隆的完整基因組測序，發(fā)現(xiàn)CB01的菌株甄別位點(diǎn)與九里株Ⅰ相完全相同，可鑒定CB01 為九里株克隆。與九里株Ⅰ相RSA 493 克隆相比，CB01 存在刪除區(qū)變異和CBU_0533 基因變異，這些變異與九里株Ⅱ相菌RSA 439 克隆的變異完全相同，這可以將CB01 進(jìn)一步鑒定為Ⅱ相菌。九里株Ⅱ相菌CB01 克隆可用做國內(nèi)貝氏柯克斯體研究用參考菌株。

與九里株Ⅱ相菌RSA 439 相比，CB01 至少有6 個(gè)SNP 差異和5 個(gè)重復(fù)序列差異，其中3 個(gè)SNP位于質(zhì)粒。可以明確CB01 是不同的九里株Ⅱ相克隆。貝氏柯克斯體菌的體外適應(yīng)性變異機(jī)制還缺乏研究，不同的適應(yīng)性變異可能與不同的培養(yǎng)體系有關(guān)。我們的測序結(jié)果可說明九里株體外適應(yīng)性變異的多樣性。國外已對貝氏柯克斯體脂多糖O 抗原的合成機(jī)制進(jìn)行了較詳細(xì)的遺傳學(xué)分析?？紤]到其他分離株的相變機(jī)制還不清楚，以及存在LPS 合成基因之外的適應(yīng)性變異，本研究也提示有必要深入探討貝氏柯克斯體Ⅰ相菌的相變異和適應(yīng)性變異機(jī)制。