李建波，江文凜，樊漢利

0 引言

肺癌的發(fā)病率及死亡率在所有惡性腫瘤中排名第一[1]，目前我國肺癌發(fā)病率及死亡率呈逐年升高趨勢，嚴(yán)重威脅國民健康[2]。早期肺癌的治療仍以手術(shù)為主，但對于晚期肺癌患者，五年生存率僅有大約4%。因此對肺癌的早期診斷和治療顯得尤為重要。目前越來越多的證據(jù)證明非編碼RNA，如mircoRNA，靶向作用于目標(biāo)基因mRNA，引發(fā)目標(biāo)mRNA的降解，從而調(diào)節(jié)致癌基因和抑癌基因的蛋白表達(dá)[3-5]。很多研究顯示，miRNA參與肺癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)控[6-8]。

人類miR-127基因位于染色體14q32.31的一個包括miR-136、miR-431、miR-432、miR-433、miR-337和miR-665的miRNA族，位于Dlk/Gtl2的印跡區(qū)域，反方向轉(zhuǎn)錄為Rtl1基因。人類miR-127基因前體可以表達(dá)兩個成熟的miRNA，miR-127-3p和miR-127-5p[9]。近年來有學(xué)者開始研究miR-127在腫瘤中的作用，如Bier等[10]的研究表明miR-127在神經(jīng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、胰腺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌中表達(dá)下調(diào)。Chen等[11]發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞系miR-127高表達(dá)后抑制細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞的遷移和侵襲。吳新華等[12]研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌miR-127低表達(dá)，宮頸癌組織miR-127表達(dá)檢測有助于預(yù)測淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和患者預(yù)后。然而miR-127在肺癌中的作用還未見報道，因此本文旨在研究miR-127在肺癌中的表達(dá)及其對肺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。

1 資料與方法

1.1 組織標(biāo)本與細(xì)胞

本次研究組織標(biāo)本來自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市普愛醫(yī)院2012年1月至2018年1月的20例肺癌患者的癌組織及其相應(yīng)癌旁組織，其中男12例、女8例，年齡43~78歲（62.3±7.45）歲，其中腺癌7例、 鱗癌 13例；病理分期為Ⅰ期7例、Ⅱ期5例、Ⅲ期4例、Ⅳ期4例。肺癌細(xì)胞株A549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)（購自美國Hyclone公司），胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.2 實時熒光定量PCR測定各組miR-127含量

采用試劑盒提取肺癌組及癌旁組織組中的總RNA，用實時熒光定量PCR法測定各組miR-127表達(dá)量，內(nèi)參使用GAPDH進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 肺癌細(xì)胞株轉(zhuǎn)染實驗

對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞密度融合為60%~70%時將細(xì)胞分為兩組：miR-127 mimics組及空白載體轉(zhuǎn)染組（negative control, NC），分別進(jìn)行miR-127 mimics及空白載體轉(zhuǎn)染，細(xì)胞轉(zhuǎn)染用Lipofectamine2000，具體步驟參照轉(zhuǎn)染試劑說明書。轉(zhuǎn)染后48 h收集細(xì)胞內(nèi)RNA檢測miR-127表達(dá)水平。

1.4 細(xì)胞克隆形成實驗

取miR-127 mimics及NC組的A549細(xì)胞，以1000個/孔接種于6孔板，細(xì)胞培養(yǎng)箱溫育1~3周，待細(xì)胞克隆形成，使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫對細(xì)胞群落進(jìn)行染色，計集落數(shù)。

1.5 MTT法檢測A549細(xì)胞增殖活性

取miR-127 mimics及空白載體轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞，以3 000個/孔接種于96孔板培養(yǎng)，實驗結(jié)束前4 h加入5 mg/ml的MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，各孔加入DMSO 150 μl，室溫振蕩10 min，于酶標(biāo)儀490 nm 波長處測定吸光度（OD）值。

1.6 Transwell實驗檢測腫瘤細(xì)胞侵襲

將Transwell小室置于24孔板后，加入miR-127 mimics和空白載體轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，小室內(nèi)加入200 ml無血清培養(yǎng)基，24孔板內(nèi)加入600 ml血清培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，擦除未通過小室濾膜的細(xì)胞，采用0.1%結(jié)晶紫對遷移細(xì)胞進(jìn)行染色、漂洗、固定，任取鏡下5個視野進(jìn)行計數(shù)，每組實驗重復(fù)3次觀察其遷移情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，研究資料數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，各組數(shù)值用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組比較采用t檢驗。方法，多組比較使用方差分析，組內(nèi)兩兩比較使用LSD檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-127在肺癌及癌旁組織中的表達(dá)

miR-127在肺癌組織（0.55±0.05）中的表達(dá)水平顯著低于癌旁組織（1.45±0.13），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001），提示miR-127可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，見圖1。

圖1 miR-127在肺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)Figure1 Expression of miR-127 in lung cancer tissues and adjacent normal tissues

2.2 miR-127的表達(dá)與肺癌病理分期的關(guān)系

病理分期為Ⅰ期的miR-127的表達(dá)處于較高水平，Ⅱ期、Ⅲ期肺癌組織的miR-127表達(dá)相對低分期組而言表達(dá)較低，Ⅳ期肺癌組織表達(dá)水平最低，統(tǒng)計分析顯示miR-127的表達(dá)水平與病理分期呈正相關(guān)（H=6.528, P=0.034），見圖2。

2.3 miR-127 mimics轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞

圖2 miR-127的表達(dá)與肺癌病理分期的關(guān)系Figure2 Relationship between miR-127 expression and pathological stage of lung cancer

將miR-127 mimics組、NC組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培養(yǎng)48 h后提取RNA檢測，miR-127的表達(dá)水平結(jié)果顯示miR-127 mimics組顯著高于NC組（P=0.0001），見圖3。

圖3 miR-127 mimics轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后miR-127的表達(dá)水平Figure3 Expression of miR-127 in A549 cells after miR-127 mimics transfection

2.4 MTT法檢測miR-127對A549細(xì)胞增殖的影響

miR-127 mimics轉(zhuǎn)染后48 h，用MTT法檢測A549細(xì)胞miR-127 mimics組和NC組中肺癌細(xì)胞的增殖，結(jié)果顯示miR-127 mimics轉(zhuǎn)染顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0045），見圖4。此外，平板克隆形成實驗表明，與NC組相比，miR-127 mimics組中的肺癌細(xì)胞A549的集落形成效率顯著降低，見圖5。

圖4 MTT法檢測miR-127對A549細(xì)胞的增殖Figure4 Proliferation of A549 cells after miR-127 mimics transfection detected by MTT assay

2.5 Transwell實驗檢測miR-127對肺癌A549細(xì)胞遷移能力的影響

采用Transwell實驗觀察miR-127 mimics組和NC組肺癌A549細(xì)胞的過膜數(shù)量，miR-127 mimics組（79±18個/視野）明顯低于NC組（352±21個/視野），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002），見圖6。

3 討論

圖5 平板克隆形成實驗檢測肺癌細(xì)胞A549的集落形成情況Figure5 Colony formation of A549 cells detected by cell colony formation assay

圖6 Transwell實驗檢測miR-127 mimics轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞的遷移能力Figure6 Migration ability of A549 cells after miR-127 mimics transfection detected by Transwell assay

肺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，其臨床死亡率呈逐年上升趨勢[1]。早期肺癌的治療仍以手術(shù)切除為主，但由于肺癌早期癥狀不明顯，大多患者就診時已屬中晚期，且因腫瘤細(xì)胞局部浸潤和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，患者失去根治性手術(shù)的機(jī)會，而且高復(fù)發(fā)率也是造成肺癌預(yù)后不理想的原因之一[13]。因此，早期診斷和治療是保障肺癌患者良好預(yù)后的關(guān)鍵因素。尋找肺癌早期診斷標(biāo)志物對及時診治肺癌具有重要意義。近年來microRNA以其在生物學(xué)過程中多樣化的調(diào)節(jié)作用而備受關(guān)注[14-15]。各種腫瘤異常的microRNA表達(dá)譜為我們研究腫瘤發(fā)生提供了新的思路。

miR-127作為mircoRNA中的一員，其在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到主要的作用。miR-127最早在胃癌、惡性膠質(zhì)瘤、乳腺癌中發(fā)現(xiàn)，后來逐漸發(fā)現(xiàn)miR-127在卵巢癌、惡性膠質(zhì)瘤、肺癌、直腸癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤中起到腫瘤抑制的作用[9-12]，然而miR-127在肺癌的發(fā)生發(fā)展中究竟起著什么樣的作用，尚不清楚。本研究收集肺癌及癌旁組織標(biāo)本，并提取標(biāo)本的miR-127表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-127在肺癌組織中表達(dá)量明顯低于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對收集到的肺癌組織以病理分級進(jìn)行分組，比較不同病理分級的肺癌組織中miR-127的表達(dá)情況，研究發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中miR-127的表達(dá)量隨著病理分級的惡性程度的增高而降低， Ⅳ期中miR-127表達(dá)量最低。miR-127在不同病理級別的肺癌組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，提示miR-127的表達(dá)可能與肺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，我們成功使用miR-127 mimics轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞株，并進(jìn)一步對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行了MTT、克隆形成實驗及Transwell實驗。MTT實驗結(jié)果顯示miR-127 mimics轉(zhuǎn)染顯著抑制肺癌細(xì)胞的增殖，克隆形成實驗表明，與NC組相比， miR-127 mimics組中的肺癌細(xì)胞A549的集落形成效率顯著降低。Transwell實驗結(jié)果顯示與NC組相比，miR-127 mimics組的細(xì)胞過膜數(shù)量減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Transwell實驗結(jié)果驗證了miR-127的表達(dá)水平與肺癌細(xì)胞的遷移能力相關(guān)，miR-127的表達(dá)量增多可以抑制肺癌細(xì)胞的增殖遷移能力。綜上所述，肺癌組織中miR-127的表達(dá)水平較正常組織低，隨著病理分級惡性程度的增高而降低，并且過表達(dá)miR-127以抑制肺癌細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)移，提示miR-127對肺癌的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮重要作用，并且與肺癌的增殖轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可作為肺癌的潛在臨床診治靶點(diǎn)，測定miR-127的表達(dá)量可以為早期診斷和治療肺癌提供新思路。