馬超，王衛(wèi)星，蘇新輝，陳國強，蘇福

0 引言

乳腺癌被列為全球第二大最常見的癌癥，是嚴重威脅女性健康的惡性腫瘤之一[1]。全世界每年約新增150萬乳腺癌患者，同時有50余萬女性死于該病[2]。目前，乳腺癌的治療提倡手術(shù)、放化療、內(nèi)分泌及分子靶向治療相結(jié)合的綜合治療措施，治療水平較以往有了很大的提高，但是整體臨床療效仍不能讓人滿意，特別是晚期乳腺癌療效依然較差。治療失敗的原因主要有原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移、治療后復(fù)發(fā)和耐藥，其中較早發(fā)生血行轉(zhuǎn)移是主要因素[3]。因此，探尋治療乳腺癌的新靶點，提高其療效是仍然是亟待解決的臨床難題。

Soker等發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖毛蛋白-1（neuropilin-1,NRP-1）與血管生成存在關(guān)系，是血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的新型受體，在血管內(nèi)皮細胞增殖和遷徙過程中有促進作用[4]。近來也有大量研究表明，NRP-1在血管生成方面起著重要作用，可能為抗血管生成治療提供潛在的靶點。NRP-1在乳腺癌中高表達，而且可作為乳腺癌的獨立預(yù)后因素[5]。已有研究通過沉默或過表達NRP-1觀察乳腺癌細胞在細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡等生物學(xué)行為方面的變化，但是關(guān)于NRP-1單克隆抗體（NRP-1 monoclonal antibody, NRP-1 MAb）治療乳腺癌裸鼠移植瘤的研究國內(nèi)外尚未見報道。

本研究將從細胞水平檢測NRP-1 MAb是否能有效識別乳腺癌MCF7細胞上的NRP-1蛋白，并從動物水平觀察NRP-1 MAb對乳腺癌MCF7細胞移植瘤生長的影響，從分子水平檢測腫瘤組織中VEGF、NRP-1的表達情況，分析潛在機制，從而為NRP-1單克隆抗體靶向藥物的研究提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、材料

RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清為GIBCO公司產(chǎn)品（美國），Hoechst染色試劑盒為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品（中國），羊抗鼠IgG-TRITC羅丹明（Tetramethylrhodamine, TRITC）熒光標記二抗為Sigma公司產(chǎn)品（美國），VEGF抗體為Abcam公司產(chǎn)品（美國），蛋白Marker/預(yù)染蛋白Marker、PVDF膜為Fermentas公司產(chǎn)品（美國），增強化學(xué)發(fā)光（Enhanced chemiluminescence,ECL）試劑盒為鷺隆公司產(chǎn)品（中國）。NPR-1單克隆抗體為廈門大學(xué)抗癌研究中心顏江華教授課題組饋贈[6]。

1.2 實驗動物、細胞株

6~8周齡SPF級雌性BALB/C裸鼠，由廈門大學(xué)動物實驗動物中心提供。乳腺癌MCF7細胞，為本實驗室保存的細胞株。

1.3 細胞培養(yǎng)

乳腺癌MCF7細胞常規(guī)培養(yǎng)（在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)），每2~3 d傳代，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.4 抗體特異性的鑒定

為了鑒定抗體的特異性，實驗設(shè)有空白對照組（Blank control, BC），陰性對照組（Negative control, NC）。收集各組細胞，提取總蛋白，進行蛋白免疫印記（Western blot）檢測。即經(jīng)SDSPAGE電泳后將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉膜后加入稀釋的NRP-1 MAb（1:1 000），4℃反應(yīng)過夜后取出用膜洗滌液（TBST）洗滌3次，加入HRP酶標二抗（1:8 000）室溫反應(yīng)1 h，洗滌5次，加入化學(xué)發(fā)光液反應(yīng)，在凝膠成像儀成像。

將MCF7接種于蓋玻片貼壁生長，當(dāng)細胞長至80%左右，用4℃預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次；加入Hoechst 染色試劑盒的固定液0.5 ml，4℃固定30 min；棄掉固定液，PBS洗3遍，3 min每次。甩干，加入1:200稀釋的NRP-1抗體，37℃孵育1 h，棄掉一抗溶液，PBS洗3遍，3 min每次；在細胞片上加1:50稀釋的羊抗鼠IgG-TRITC熒光標記二抗，37℃避光孵育1 h，棄掉熒光二抗，PBS洗3遍，3 min每次；加入0.5 ml Hoechst染色液，于搖床上晃動，室溫染色5 min，棄掉染色液，用PBS洗滌3遍。甩干，滴1滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的玻片，盡量避免氣泡；共聚焦掃描顯微鏡下觀察，其中Hoechst激發(fā)波長在350 nm左右，發(fā)射波長在460 nm左右；而TRITC最大吸引光波長為550 nm，最大發(fā)射光波長為620 nm。

1.5 裸鼠移植瘤模型的建立

取對數(shù)生長期的乳腺癌MCF7細胞，0.25%胰酶消化后加入含血清培養(yǎng)基中和胰酶，吹打成單細胞懸液。用PBS離心洗滌3次，棄上清液，細胞沉淀用PBS制成1×107個/毫升單細胞懸液，以每只0.2 ml注入裸鼠右前腋下。接種后隔天觀察1次小鼠，記錄皮下接種點的成瘤情況。當(dāng)皮下成瘤并生長至約800 mm3時開始傳代，剝離瘤塊剪切成均勻的小塊（2 mm×2 mm×2 mm），移植到30~35只裸鼠右前腋部皮下。

1.6 分組及用藥

當(dāng)小鼠移植瘤瘤體長至約100 mm3將荷瘤裸鼠按隨機數(shù)字表法分為4組，每組6只。對照組（PBS組）腹部皮下注射PBS，0.2 ml，2次/周；NRP-1 MAb低劑量組腹部皮下注射NRP-1 MAb，1 mg/kg，2次/周；NRP-1 MAb 中劑量組腹部皮下注射NRP-1 MAb，5 mg/kg，2次/周；NRP-1 MAb高劑量組腹部皮下注射NRP-1 MAb，10 mg/kg，2次/周。以上各組均于瘤組織移植接種后第3天開始給藥，共給藥7次。

1.7 腫瘤重量、體積測量及抑瘤率

模型分組給藥后，每天觀察裸鼠的一般情況并記錄：精神狀態(tài)、食欲、體重等。隔5天測一次腫瘤長徑（a）、短徑（b）和小鼠體重。于治療后第33天脫頸處死，剝離完整腫瘤，稱重，投入液氮中保存、備用。用Steel公式計算腫瘤體積（V）。V = a×b2/2。抑瘤率（Tumor Growth Inhibition, TGI）（%）= （Cx-Tx）/Cx×100%（Cx為給藥結(jié)束后PBS組測量的平均腫瘤體積，Tx為給藥結(jié)束后各治療組測量的平均腫瘤體積）。根據(jù)測量數(shù)據(jù)繪制治療后腫瘤質(zhì)量的變化，以及實驗進程中小鼠體重變化等圖表。

1.8 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達

腫瘤組織研磨破碎，加蛋白裂解液，提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將等量蛋白樣品點于SDS-聚丙烯酰胺凝膠小孔進行電泳。電泳后進行轉(zhuǎn)膜，將轉(zhuǎn)好的PVDF膜用TBST洗滌后、浸沒于封閉液封閉，然后根據(jù)預(yù)染Marker所指示大小，將內(nèi)參條帶（GAPDH）和目的條帶（VEGF、NRP-1）剪開，分別加入對應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，加入相應(yīng)的二抗孵育30 min，洗滌數(shù)次，滴加ECL顯影劑，通過設(shè)備曝光顯影觀察蛋白條帶。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件對原始數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，最終結(jié)果數(shù)據(jù)用樣本均數(shù)t檢驗分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NRP-1單克隆抗體的特異性

Western blot。方法檢測抗體特異性結(jié)果顯示NRP-1 MAb能夠與線性NRP-1蛋白結(jié)合，無明顯雜帶，見圖1A。說明抗體特異性良好，且能應(yīng)用于后續(xù)實驗，即采用Western blot。方法檢測腫瘤細胞PD-L1蛋白的表達量。

NRP-1 MAb孵育的乳腺癌細胞MCF7后經(jīng)免疫熒光染色，使用熒光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。當(dāng)使用550 nm做激發(fā)光，檢測TRITC的熒光時，對照組的細胞檢測不到紅色熒光，而經(jīng)NRP-1 MAb（標記有TRITC熒光）處理的細胞可以看到清晰的紅色熒光；當(dāng)使用350 nm做激發(fā)光，檢測Hoechst的熒光時，可見細胞核帶有藍色熒光，且未對細胞核的形態(tài)造成損傷；將2個圖像融合，融合圖像顯示未加抗體的細胞膜未出現(xiàn)紅色熒光，而加入NRP-1 MAb的有紅色熒光，且主要呈現(xiàn)在細胞膜上，見圖1B。結(jié)果表明，NRP-1 MAb能夠有效識別乳腺癌細胞MCF7上天然的NRP-1蛋白，且主要定位在細胞膜上。

2.2 各組裸鼠體重及腫瘤體積、重量的變化

實驗進程中，各組荷瘤小鼠生長狀況良好，飲食規(guī)律，排泄無異常，無意外傷害及死亡，成瘤率100%。腫瘤體積從給藥后第3天開始測量，根據(jù)各個時間點的測量結(jié)果繪制腫瘤生長曲線。數(shù)據(jù)顯示從第13天開始實驗組的腫瘤體積明顯要小于對照組（P=0.00018），不同NRP-1 MAb劑量給藥組的抑瘤率隨著給藥劑量的增加而增高。NRP-1 MAb低劑量組（1 mg/kg）抑瘤率為47.01%，NRP-1 MAb中劑量組（5 mg/kg）抑瘤率為65.70%，NRP-1 MAb高劑量組（10 mg/kg）抑瘤率為69.19%，見圖2。腫瘤的生長依賴于新生血管提供養(yǎng)分，而NRP-1在腫瘤血管生成中充當(dāng)重要角色。NRP-1 MAb理論上可通過阻斷NRP-1與其受體結(jié)合，抑制腫瘤血管生成，進而影響腫瘤的增長速度。實驗結(jié)果顯示與該推斷一致。給藥治療33天后，剝離腫瘤組織稱重，實驗組的腫瘤明顯小于對照組（高中低組相應(yīng)的P值為：0.029、0.025、0.016），見圖3。隨著荷瘤小鼠給藥進程，小鼠體重增長差異不大，無體重驟減現(xiàn)象，見圖4。說明NRP-1 MAb用藥對荷瘤小鼠毒副作用小。

圖1 Western blot法(A)和共聚焦免疫熒光法(B)分析NRP-1 MAb的特異性Figure1 Specificity of NRP-1 MAb in MCF7 cells analyzed by Western blot(A) and Confocal immunof l uorescent analysis(B)

圖2 治療后各組裸鼠腫瘤的生長曲線(A)及大小(B)Figure2 Growth curves(A) and size(B) of tumors in nude mice after treatment

圖3 治療后各組裸鼠瘤體平均瘤重Figure3 Mean weight of tumors in nude mice after treatment

2.3 腫瘤組織中VEGF和NRP-1蛋白的表達

Western blot法分析各組中NRP-1和VEGF的表達。以GAPDH為內(nèi)參蛋白進行調(diào)平，結(jié)果顯示對照組腫瘤組織中NRP-1和VEGF均有表達，不同劑量用藥組NRP-1和VEGF的表達則呈現(xiàn)遞減趨勢，見圖5。

3 討論

圖4 治療后各組裸鼠體重變化情況Figure4 Change of body weight of nude mice after treatment

圖5 Western blot檢測各組腫瘤組織中NRP-1和VEGF的表達Figure5 Expression of VEGF and NRP-1 in tumors of each group detected by Western blot

我國乳腺癌的發(fā)病率逐年上升，且具有年輕化的趨勢。近年來，NRP-1如何參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程已成為研究熱點。在乳腺癌的研究中顯示，惡性、癌前病變的乳腺樣本中腫瘤脈管系統(tǒng)和腫瘤細胞表達有NRP-1蛋白，顯示NRP-1可能和乳腺癌生長和進展有關(guān)[7]。

NRP-1作為VEGFR-2的共受體可增強VEGF165與VEGFR-2的結(jié)合，增加VEGFR2的蛋白磷酸化程度，負責(zé)誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞趨化作用，促進腫瘤血管生成[8]。而且，NRP-1還能夠以不依賴VEGF的方式，通過與酪氨酸激酶ABL1形成復(fù)合物，重塑肌動蛋白，誘導(dǎo)血管新生[9]。Bachelder等[10]發(fā)現(xiàn)惡性乳腺癌細胞中激活VEGF誘導(dǎo)的PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用是非常重要的。在NRP-1陽性、VEGFR2陰性的乳腺癌細胞株中，VEGF165通過激活PI3k激酶通路阻止凋亡，并與NRP-1的水平和細胞生存直接相關(guān)[11]。另外，在介導(dǎo)乳腺癌遷移和轉(zhuǎn)移中NRP-1也起了重要作用。這些研究共同提示了抗NRP-1可能為靶向治療乳腺癌提供新的途徑。

傳統(tǒng)化療藥物旨在短時間內(nèi)最大程度殺傷腫瘤細胞，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡，但較長的化療間歇使得受損的腫瘤血管系統(tǒng)得以重建，不能帶來持久療效，且不良反應(yīng)大，常伴有腫瘤耐藥。靶向治療作為據(jù)手術(shù)、放療、化療三大傳統(tǒng)治療手段之外的一種全新的治療。方法，特異性強、不良反應(yīng)小，能夠改善化療藥的弊端。以NRP-1為靶點的分子靶向治療研究，在結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等瘤種的體內(nèi)外實驗中體現(xiàn)出較好的抗腫瘤療效[12]。

本研究在細胞水平上，通過Western blot和共聚焦免疫熒光法檢測NRP-1 MAb的特異性，結(jié)果顯示其可有效結(jié)合乳腺癌細胞MCF7上的NRP-1蛋白。NRP-1在腫瘤生長、發(fā)展中參與血管新生、腫瘤細胞侵襲等過程，本研究在動物水平上，探討了NRP-1 MAb以不同劑量治療乳腺癌細胞裸鼠移植瘤，不同NRP-1 MAb劑量給藥組的抑瘤率隨著給藥劑量的增加而增高。為了進一步闡釋療效的潛在機制，本研究在分子水平上，初步檢測了腫瘤組織中的VEGF和NRP-1的表達情況，結(jié)果顯示高劑量用藥后腫瘤組織中VEGF和NRP-1表達量下調(diào)，證實NRP-1 MAb可通過下調(diào)VEGF和NRP-1表達，而抑制腫瘤的增長。但是荷瘤小鼠腫瘤生長抑制實驗結(jié)果顯示，中、高濃度抗體的抑瘤作用卻沒有低濃度顯著，提示腫瘤發(fā)生發(fā)展是個綜合復(fù)雜的過程，涉及多物質(zhì)多通路的參與，NRP-1 MAb抑制腫瘤生長不是唯一途徑，只是機體中的一種途徑，后續(xù)研究可以考慮聯(lián)合用藥來提高抗體在實際應(yīng)用中的有效性。綜上，NRP-1 MAb可能通過結(jié)合NRP-1蛋白而下調(diào)VEGF和NRP-1的表達，從而減少腫瘤組織中血管的生成，發(fā)揮一定的抑制腫瘤增長的作用。