林戀竹，朱啟源，趙謀明*

（華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640）

辣木（Moringa oleifera）是多年生熱帶落葉喬木，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國云南、廣東、廣西、福建、臺灣等地區(qū)均有大面積種植，資源量極其豐富[1]。辣木籽含有豐富的脂質(zhì)（質(zhì)量分數(shù)30.8%～41.2%）和蛋白質(zhì)（質(zhì)量分數(shù)29.4%～38.3%）[2]。目前，針對辣木籽油高效提取方法的研究較多，取得了較好的進展[3-6]。辣木籽蛋白中Val、Leu、Ile、His等多種氨基酸的含量接近或遠高于聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織標準模式譜，可作為優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源加以開發(fā)[7-9]。然而，目前針對辣木籽蛋白的精深加工技術及其在食品工業(yè)中的應用研究較少。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）所造成的氧化損傷會導致衰老、動脈粥樣硬化、糖尿病、癌癥等的發(fā)生發(fā)展[10-11]。“健康中國2030”已列入國家發(fā)展戰(zhàn)略，保健食品產(chǎn)業(yè)是健康戰(zhàn)略的重要組成部分，高品質(zhì)的保健食品具有巨大的市場需求。因此，以辣木籽為原料通過食品加工技術開發(fā)具有抗氧化活性的生物活性肽用作保健食品配料，可為辣木籽肽作為高效抗氧化劑應用于保健食品提供理論與方法指導。

本研究采用酶法制備辣木籽水解物，以抗氧化活性為跟蹤指標，通過乙醇分級沉淀和大孔樹脂柱層析法定向制備辣木籽抗氧化肽，構建模擬胃、腸道消化模型，評價辣木籽抗氧化肽胃、腸道消化物的氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC），解析消化物中多肽組成與結構，研究經(jīng)胃、腸道消化后的辣木籽抗氧化肽對氧化損傷紅細胞溶血的抑制作用，基于生物可接受度評價辣木籽肽的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料、實驗動物與試劑

辣木籽 廣東華谷辣木生物科技有限公司。

大鼠 廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心（許可證號：SCXK（粵）2013-0020）。

N S 3 7 0 7 1蛋白酶 丹麥諾維信公司；熒光素鈉、2,2’-偶氮二異丁脒鹽酸鹽（2,2’-azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride，AAPH）、水溶性VE（Trolox）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、谷胱甘肽（glutathione，GSH） 美國Sigma公司；pH 7.4 basic磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）（1×） 美國Thermo Scientific公司；XAD-16大孔樹脂 北京慧德易科技有限責任公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、氰化高鐵血紅蛋白試劑盒 南京建成生物工程研究所；純肽（Gln-Met、Leu-Phe） 吉爾生化（上海）有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Sorvall ST16R高速冷凍離心機、Varioskan Flash全波長掃描多功能讀數(shù)儀 美國Thermo Scientific公司；Alpha 1-4 LD冷凍干燥機 德國Christ公司；A300全自動氨基酸分析儀 德國GE Healthcare公司；Impact II四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（quadrupole time of fl ight-tandem mass spectrometry，QTOF-MS/MS）儀 德國Bruker公司；ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）儀 美國Waters公司；KND-2C凱氏定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；UV-754紫外-可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 辣木籽抗氧化肽的制備

1.3.1.1 酶法制備辣木籽水解物

辣木籽干燥后脫殼，粉碎過80 目篩，稱取辣木籽粉1 600 g，100 ℃蒸汽處理20 min，按料液比1∶6加入蒸餾水，攪拌均勻。用1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)混懸液至pH 8.0，60 ℃攪拌1 h。調(diào)節(jié)至pH 8.0，加入辣木籽粉質(zhì)量分數(shù)2.5%的NS37071蛋白酶，55 ℃酶解24 h后沸水浴中滅活15 min，冷卻至室溫，10 000×g離心30 min，用移液槍吸除油層后取上清液，55 ℃減壓濃縮，取100 mL冷凍干燥，得辣木籽水解物。收集剩余的濃縮液，備用。

1.3.1.2 乙醇分級沉淀

在1.3.1.1節(jié)濃縮液中加入一定體積的無水乙醇，使體系中乙醇的最終體積分數(shù)為20%，攪拌均勻后4 ℃靜置12 h，4 500×g離心30 min，得到沉淀物1和上清液1，將沉淀物1溶于水中，55 ℃減壓濃縮去除乙醇，冷凍干燥，得20%（體積分數(shù)，下同）醇沉組分。將上清液1減壓濃縮，加入無水乙醇，使體系中乙醇的最終體積分數(shù)為40%，攪拌均勻，4 ℃靜置12 h，4 500×g離心30 min，制得沉淀物2和上清液2，將沉淀物2溶于水中，55 ℃減壓濃縮去除乙醇，冷凍干燥，得40%醇沉組分。以此類推，分別制得60%醇沉組分、80%醇沉組分，收集剩余的上清液，55 ℃減壓濃縮，冷凍干燥，得上清液組分。

1.3.1.3 大孔樹脂柱層析

取大孔樹脂XAD-16加入無水乙醇浸泡12 h，溶脹后抽濾去除乙醇，加入蒸餾水反復洗滌樹脂至無醇味。加入1.0 mol/L NaOH溶液浸泡4 h，抽濾除去NaOH溶液，并用蒸餾水反復洗滌大孔樹脂直至洗滌液的pH值為7.0。加入1.0 mol/L HCl溶液浸泡4 h，抽濾除去HCl溶液，并用蒸餾水反復洗滌大孔樹脂直至洗滌液的pH值為7.0。采用濕法裝柱（2.5 cm×120 cm），上樣后將層析柱放入4 ℃層析柜中靜置12 h；在室溫下依次用蒸餾水以及體積分數(shù)20%、40%、60%乙醇進行動態(tài)解吸，并控制洗脫劑流速為5 mL/min，分別收集洗脫液，55 ℃減壓濃縮除去乙醇，冷凍干燥，得到各洗脫組分。

1.3.2 體外抗氧化活性評價

1.3.2.1 ORAC測定

在96 孔板各微孔中分別加入20 μL樣品或75 mmol/L PBS（pH 7.4）（空白對照），加入120 μL 70 nmol/L熒光素鈉，將96 孔板置于酶標儀中，37 ℃孵育15 min，迅速加入60 μL 40 mmol/L AAPH混勻啟動反應并開始測定（初始熒光強度記為f0）。激發(fā)波長485 nm、發(fā)射波長520 nm，每1 min讀數(shù)1 次，共讀121 次（熒光強度記為fn，n＝1，2，3，……，121）[12]。將每次讀數(shù)值連成曲線，按式（1）計算曲線下的面積（AUC）。

配制濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol/L Trolox溶液，按以上步驟進行測定，按式（2）計算Net AUC。以Trolox濃度為橫坐標、Net AUC為縱坐標繪制標準曲線，計算樣品的ORAC，以每克樣品與Trolox擁有相同的ORAC時相當于Trolox的物質(zhì)的量計（μmol/g）。

式中：AUCsample、AUCblank分別表示樣品、空白對照曲線下的面積。

1.3.2.2 DPPH自由基清除能力測定

吸取適宜濃度樣品溶液2 mL，加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，混勻，室溫避光反應30 min，測定517 nm波長處的吸光度A樣品；用2 mL無水乙醇代替樣品溶液，測定吸光度A對照；用2 mL無水乙醇代替DPPH無水乙醇溶液，測定吸光度按式（3）計算DPPH自由基清除率。

配制濃度為0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mmol/L Trolox溶液，按以上步驟進行測定，計算DPPH自由基清除率，以Trolox濃度為橫坐標、DPPH自由基清除率為縱坐標繪制標準曲線，計算樣品的DPPH自由基清除能力，以每克樣品與Trolox擁有相同的DPPH自由基清除能力時相當于Trolox的物質(zhì)的量計（μmol/g）。

1.3.3 蛋白質(zhì)量分數(shù)的測定

蛋白質(zhì)量分數(shù)采用GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》凱氏定氮法進行測定。

1.3.4 水解氨基酸的測定

在安瓿瓶中加入10 mg樣品和5 mL 6 mol/L HCl溶液，密封，110 ℃水解24 h，冷卻、過濾、干燥。加入2 mL乙酸鈉鹽緩沖液（pH 2.0）溶解，過0.22 μm濾膜，采用自動氨基酸分析儀測定水解氨基酸組成與質(zhì)量分數(shù)[14]。

1.3.5 基于生物可接受度評價辣木籽肽的抗氧化活性

1.3.5.1 模擬胃、腸道消化辣木籽抗氧化肽

配制10 mg/mL樣品溶液，用1.0 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)至pH 2.0，加入樣品質(zhì)量分數(shù)2%的胃蛋白酶，攪拌均勻，37 ℃孵育2 h；用1.0 mol/L NaHCO3溶液調(diào)節(jié)至pH 5.3，接著用1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)至pH 7.5，加入樣品質(zhì)量分數(shù)2%的胰酶，攪拌均勻，37 ℃孵育2 h。每隔0.5 h取樣，沸水浴中滅活，冷卻，6 000×g離心15 min，取上清液，測定ORAC，以每克樣品蛋白與Trolox擁有相同的ORAC時相當于Trolox的物質(zhì)的量計（μmol/g）。取消化4 h的消化物離心，取上清液冷凍干燥，制得辣木籽抗氧化肽消化物[15]。

1.3.5.2 UPLC-QTOF-MS/MS解析消化物中多肽組成與結構

UPLC條件：ACQUITY UPLC T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），柱溫35 ℃，流速200 μL/min。洗脫劑由體積分數(shù)0.1%甲酸溶液（A）和乙腈（B）組成，梯度洗脫程序：0 min，70% A；0～6 min，70%～40% A；6～7 min，40%～20% A；7～8 min，20%～70% A；8～10 min，70% A。進樣量1 μL。MS條件：掃描范圍m/z 50～2 000；正離子模式；毛細管電壓3 500 V；霧化器壓力5×104Pa；干燥氣（氮氣）流速4 L/min；干燥器溫度200 ℃；掃描模式：auto MS/MS模式。利用Data Analysis 4.3軟件解析多肽結構。

1.3.5.3 辣木籽抗氧化肽胃、腸道消化物對氧化損傷紅細胞的保護作用

大鼠紅細胞懸液配制：取健康大鼠腹主動脈血液，4 ℃、1 200×g離心10 min，去除上層血漿和中部的白膜層（血小板、淋巴細胞、單核細胞和中性粒細胞），用預冷的pH 7.4 basic PBS（1×）洗滌底層紅細胞，并配制成質(zhì)量分數(shù)20%大鼠紅細胞懸液[16]。

溶血率測定：取200 μL質(zhì)量分數(shù)20%紅細胞懸液，分別加入10 μL終質(zhì)量濃度為250 μg/mL（低劑量，L）、625 μg/mL（中劑量，M）、1 250 μg/mL（高劑量，H）的樣品溶液或生理鹽水，37 ℃預保護30 min；加入200 μL 400 mmol/L AAPH溶液或生理鹽水，37 ℃孵育1.5 h，輕輕吹打，從中吸取兩份150 μL反應液：一份加入450 μL生理鹽水，混勻后4 ℃ 1 200×g離心10 min，取上清液，在540 nm波長處測定吸光度A；另一份加入450 μL雙蒸水，混勻后4 ℃ 1 200×g離心10 min，取上清液，在540 nm波長處測定吸光度A0，以不加AAPH、不加樣品為正常組，以加AAPH、不加樣品為模型組。按式（4）計算溶血率。

高鐵血紅蛋白質(zhì)量分數(shù)、MDA含量、SOD活力測定：取紅細胞懸液，用pH 7.4 basic PBS（1×）洗滌并4 ℃ 1 200×g離心10 min 2 次，棄去上清液，加入預冷的雙蒸水使紅細胞完全溶血，4 ℃ 8 000×g離心10 min，收集上清液，按照試劑盒說明書分別測定高鐵血紅蛋白質(zhì)量分數(shù)、MDA含量、SOD活力。其中，MDA含量、SOD活力均以血紅蛋白計。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

2 結果與分析

2.1 辣木籽抗氧化肽的制備

2.1.1 辣木籽水解物的酶法制備與乙醇分級沉淀純化

表1 辣木籽水解物、乙醇分級沉淀組分和大孔樹脂柱層析組分的蛋白質(zhì)量分數(shù)和抗氧化活性Table 1 Protein contents and antioxidant activities of Moringa oleifera seed hydrolysate and fractions obtained by ethanol fractional precipitation and macroporous resin column chromatography

辣木籽水解物蛋白質(zhì)量分數(shù)為60.37%（表1），且呈現(xiàn)一定的抗氧化活性。因此，有必要以抗氧化活性為跟蹤指標對其進行分離純化，定向制備出純度高、活性強的抗氧化肽。

乙醇通過特異性結合多肽，改變多肽結構和相互作用性質(zhì)，沉淀多肽，不同體積分數(shù)乙醇溶液與多肽的相互作用不同，從而將具有不同結構特性的多肽進行分離[17]。本研究首先采用乙醇分級沉淀法對辣木籽水解物進行初級分離，得到5 個不同的乙醇分級沉淀組分（表1）。結果表明：各乙醇分級沉淀組分的抗氧化活性均高于辣木籽水解物，說明辣木籽水解物中各組分存在拮抗作用，影響了其抗氧化活性的發(fā)揮。乙醇分級沉淀法可將各組分有效分離，提升辣木籽水解物的抗氧化活性。其中，60%醇沉組分蛋白質(zhì)量分數(shù)最高，且抗氧化活性較高，因此選取該組分進行下一步分離純化。

2.1.2 大孔樹脂柱層析法分離純化

大孔樹脂具有安全性高、選擇性好、吸附速度快等優(yōu)點，受到廣泛關注和認同[18-19]。本團隊前期采用大孔樹脂柱層析法對醬油中呈鮮味肽進行高效分離[20]，說明其是一種高效分離純化多肽的方法。本研究采用XAD-16樹脂柱層析法分離60%醇沉組分，獲得4 個洗脫組分（表1）。結果表明：所得4 個洗脫組分抗氧化活性存在顯著差異，以60%乙醇洗脫組分蛋白質(zhì)量分數(shù)最高（92.84%），抗氧化活性最強（DPPH自由基清除能力和ORAC分別為39.95、1 454.57 μmol/g，分別是辣木籽水解物的17.0 倍和8.5 倍）。說明XAD-16樹脂柱層析法可對60%醇沉組分中抗氧化肽進行有效分離，得到60%乙醇洗脫組分（下稱辣木籽抗氧化肽）。

2.1.3 氨基酸組成分析

表2 辣木籽水解物和辣木籽抗氧化肽的氨基酸組成分析Table 2 Amino acid composition of Moringa oleifera seed hydrolysate and antioxidant peptide

多肽的抗氧化活性與其氨基酸組成密切相關，含有抗氧化氨基酸（Tyr、Cys、His、Met）、疏水性氨基酸（Leu、Ile、Pro、Phe等）的多肽能夠有效清除自由基[21-23]。本實驗對比研究了辣木籽水解物和辣木籽抗氧化肽的氨基酸組成與質(zhì)量分數(shù)（表2）。結果表明：辣木籽水解物中，酸性氨基酸和疏水性氨基酸的質(zhì)量分數(shù)較高（共占總氨基酸的59.80%）。辣木籽抗氧化肽富含抗氧化氨基酸、疏水氨基酸（共占總氨基酸的54.37%），具有更強的抗氧化活性，說明這兩類氨基酸對辣木籽肽的抗氧化活性有重要貢獻。

2.2 基于生物可接受度評價辣木籽肽的抗氧化活性

生物可接受度是營養(yǎng)物可被機體吸收利用的程度，指的是營養(yǎng)物直接進入人體的消化系統(tǒng)并可被人體胃、腸道溶解的部分，是評價營養(yǎng)有效性的一個關鍵指標[24-26]。

蛋白質(zhì)和多肽進入人體后，被胃、腸道中的多種酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和上皮細胞表面的肽酶）水解，所釋放的短肽被吸收并通過血液循環(huán)到達靶器官[27-29]。因此，基于生物可接受度評價辣木籽肽的抗氧化活性，可為辣木籽肽作為高效抗氧化劑應用于保健食品提供理論與方法指導。

2.2.1 模擬胃、腸道消化對辣木籽抗氧化肽ORAC的影響

圖1 模擬胃、腸道消化對辣木籽抗氧化肽ORAC的影響Fig. 1 Effect of simulated gastrointestinal digestion on ORAC of antioxidant peptide

如圖1所示，辣木籽抗氧化肽經(jīng)過胃、腸道消化后ORAC呈現(xiàn)上升趨勢。說明胃、腸道酶系可進一步水解辣木籽抗氧化肽，生成抗氧化活性更強的片段。

2.2.2 UPLC-QTOF-MS/MS解析消化物中多肽組成與結構

從辣木籽抗氧化肽消化物中共鑒定出11 條二肽和5 條三肽（表3）。其中含有抗氧化氨基酸的肽有5 條（Gln-His（QH）、Cys-Pro（CP）、Gln-Met（QM）、Gln-Arg（QR）、Gln-Met-Phe（QMF）），含有疏水性氨基酸的肽有9 條（Pro-Arg（PR）、Ala-Arg（AR）、Gly-Leu(Ile)（GL(I)）、Val-Glu（VE）、Leu(Ile)-Gln（L(I)Q）、Leu(Ile)-Phe（L(I)F）、Val-Leu(Ile)（VL(I)）、Ala-Leu(Ile)-Pro（AL(I)P）、Pro-Leu(Ile)-Gln（PL(I)Q）），既含有抗氧化氨基酸又含有疏水性氨基酸的肽有2 條（Ser-Ala-Cys（SAC）、Trp-Val-His（WVH））。由此可見，消化物中含有較多容易吸收[30]且具有潛在抗氧化活性的短肽。

表3 UPLC-QTOF-MS/MS分離鑒定辣木籽抗氧化肽胃、腸道消化物中多肽組成與結構Table 3 Peptide pro filing of gastrointestinal digest of antioxidant peptide by UPLC-QTOF-MS/MS

2.2.3 辣木籽抗氧化肽胃、腸道消化物對氧化損傷紅細胞的保護作用

本研究對比了辣木籽抗氧化肽胃、腸道消化物、1 條含抗氧化氨基酸的二肽（Gln-Met）、1 條含疏水性氨基酸的二肽（Leu-Phe）和GSH對氧化損傷紅細胞的保護作用（圖2）。結果表明：經(jīng)AAPH損傷后，紅細胞發(fā)生溶血，溶血率為48.85%，與正常組（5.28%）相比具有顯著性差異（P＜0.05）（圖2a）。辣木籽抗氧化肽胃、腸道消化物、Gln-Met、Leu-Phe和GSH可顯著抑制AAPH損傷紅細胞發(fā)生溶血，且隨多肽質(zhì)量濃度增加溶血率顯著降低，4 種多肽對氧化損傷紅細胞的保護作用從強到弱依次是Gln-Met＝GSH＞辣木籽抗氧化肽＞Leu-Phe。

圖2 辣木籽抗氧化肽胃、腸道消化物對氧化損傷紅細胞的保護作用Fig. 2 Protective effect of gastrointestinal digest of antioxidant peptide on oxidatively damaged erythrocytes

AAPH誘導產(chǎn)生的ROS可引起細胞中脂質(zhì)過氧化，上調(diào)MDA含量（圖2b）。紅細胞經(jīng)AAPH損傷后，MDA含量為5.71 nmol/mg，是正常組（2.47 nmol/mg）的2.31 倍。4 種多肽可顯著下調(diào)氧化損傷紅細胞中MDA含量，且隨多肽質(zhì)量濃度增加胞內(nèi)MDA含量顯著下降，說明4 種多肽可有效清除ROS，下調(diào)MDA含量。其中，Gln-Met在低、中、高3 個劑量下均可顯著降低胞內(nèi)MDA含量至正常組水平。

在此基礎上，本研究對比了4 種多肽對氧化損傷紅細胞中SOD活力的影響（圖2c）。結果表明：模型組SOD活力顯著高于正常組，說明ROS的過量產(chǎn)生激活了細胞中酶抗氧化防御系統(tǒng)，使得SOD活力升高[31-32]。4 種多肽可在一定程度上下調(diào)SOD活力，說明這4 種多肽均能有效降低細胞內(nèi)ROS水平。少量ROS不足以激活酶抗氧化防御系統(tǒng)，因此，減少細胞中酶抗氧化防御系統(tǒng)對AAPH所致氧化應激的應答可使SOD活力下降。

3 結 論

采用酶法制備辣木籽水解物，通過乙醇分級沉淀和大孔樹脂柱層析法定向制備辣木籽抗氧化肽，得到了高純度（蛋白質(zhì)量分數(shù)為92.84%）、富含抗氧化氨基酸（DPPH自由基清除能力、ORAC分別為39.95、1 454.57 μmol/g，分別為辣木籽水解物的17.0 倍和8.5 倍）、疏水性氨基酸的辣木籽抗氧化肽。

基于生物可接受度評價辣木籽肽的抗氧化活性實驗中，辣木籽抗氧化肽經(jīng)模擬胃、腸道消化后，抗氧化活性增強，釋放出更多短肽段，包括11 條二肽和5 條三肽。辣木籽抗氧化肽消化物、Gln-Met、Leu-Phe通過清除胞內(nèi)ROS，下調(diào)MDA含量與SOD活力，拮抗AAPH所致氧化應激，有效抑制氧化損傷紅細胞發(fā)生溶血。辣木籽抗氧化肽具有很強的自由基清除能力，且生物利用度高，可以作為天然抗氧化劑用于保健食品。