呂松潔，張樹山，戴建軍，孫玲偉，葛 雷，梁 菲，張德福*

(1上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海201306；2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；3上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室動物遺傳工程研究室，上海 201106；4浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院生殖生理研究所，杭州 310013)

21世紀(jì)以來，人工授精技術(shù)越來越多地應(yīng)用在畜牧生產(chǎn)上，在集約化、規(guī)?；a(chǎn)中效果突出。凍精便于儲存和運(yùn)輸，減少空間和時間對人工授精的制約，可大大提高良種的利用率，對繁育工作有重要意義[1]。家畜精液冷凍技術(shù)研究始于1952年，由Polge[2]等首次成功應(yīng)用并繁育出小牛，之后在豬、牛等家畜上得到廣泛應(yīng)用[3-4]。我國于20世紀(jì)70年代開始研究山羊和綿羊精液冷凍技術(shù)，解凍后活率約35%[5]。人工授精受胎率低是目前綿羊凍精推廣應(yīng)用面臨的主要問題。影響受胎率的因素有很多，一方面綿羊精子易受化學(xué)毒性、溫度變化、氧化、滲透壓和細(xì)胞機(jī)械等損傷[6]，另一方面凍精稀釋液、凍精制作和解凍程序等各個環(huán)節(jié)均影響凍精品質(zhì)[7]。湖羊是皮、毛、肉兼用的綿羊品種，經(jīng)濟(jì)效益高，在我國分布范圍廣，本研究擬在前期相關(guān)工作基礎(chǔ)上，通過交叉試驗(yàn)，進(jìn)一步篩選最佳稀釋液配方和最適解凍條件，為提高湖羊的精液冷凍技術(shù)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

選取上海永輝羊業(yè)有限公司的4頭健康、2.5歲、性成熟的湖羊種公羊，圈養(yǎng)，每日定時飼喂精飼料和草料。

1.2 稀釋液配制

稀釋液的配方如表1所示。1、2、3、5、6、7號稀釋液配制方法為：稱取各成分，定容至100 mL，混勻；取80 mL，加入20 mL卵黃，混勻；取94 mL，加入6 mL甘油，混勻；加入雙抗200 IUmL。4號稀釋液配制方法為：稱取各成分，定容至85 mL，混勻；加入15 mL卵黃，混勻；再取94 mL，加入6 mL甘油，混勻；加入雙抗200 IUmL。1—7號稀釋液配置后，按每份15 mL進(jìn)行分裝，-20 ℃保存。

表1 湖羊凍精冷凍稀釋液配制

1.3 精液處理

1.3.1 精液采集

采用假陰道法采集4頭種公羊精液于試管中，37 ℃水浴恒溫保存，現(xiàn)場立即進(jìn)行常規(guī)品質(zhì)檢查[8]，活力達(dá)到80%以上的精子用于后續(xù)試驗(yàn)操作。

1.3.2 精液稀釋

將4頭種公羊的精液混勻，均分7份，精液與稀釋液比例為1∶3，向各組精液中添加相應(yīng)配方稀釋液，輕輕混勻，37 ℃水浴10 min，4 ℃條件緩慢降溫，平衡2.5 h。

1.3.3 精液冷凍

在4 ℃條件下抽取0.2 mL各精液樣品，置于0.25 mL細(xì)管中，封口。迅速將細(xì)管置于液氮上方3 cm處，熏蒸15 min，之后迅速將細(xì)管投入液氮中冷凍保存。

1.3.4 精液解凍

凍存的細(xì)管精液經(jīng)不同溫度及時間解凍，經(jīng)過預(yù)試驗(yàn)后，確定了試驗(yàn)條件范圍，分別為70 ℃ 3 s、70 ℃ 5 s、70 ℃ 8 s、42 ℃ 15 s、42 ℃ 17 s、42 ℃ 20 s。擦除細(xì)管表面水珠后，剪掉兩端，收集精液于對應(yīng)的1 mL稀釋液中，37 ℃孵育30 min。

1.4 精液品質(zhì)檢測

1.4.1 精子活率和活力檢測

使用一次性精子計(jì)數(shù)板(邁朗，SJ-TMDI608)進(jìn)行精子活率和活力檢測。將解凍并孵育30 min的精液輕輕混勻，取15 μL精液滴在37 ℃預(yù)熱的計(jì)數(shù)板上，于200倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個視野，精子分析儀(邁朗，SJ-TMDI608)自動識別運(yùn)動精子、直線運(yùn)動精子和死亡精子數(shù)量，經(jīng)計(jì)算后形成活率和活力數(shù)據(jù)?；盥蕿檫\(yùn)動精子占總精子數(shù)的比例，活力為直線運(yùn)動精子占總精子數(shù)的比例。

1.4.2 精子質(zhì)膜完整率檢測

采用低滲腫脹法(HOST)檢測精子質(zhì)膜完整性[9]。取10 μL解凍精液加到100 μL 經(jīng)37 ℃預(yù)熱的HOST低滲溶液(0.9 g果糖、0.49 g檸檬酸鈉、溶于100 mL雙蒸水中)中，37 ℃水浴1 h，于200倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選擇5個視野，計(jì)算彎尾精子數(shù)占總精子數(shù)的比例。

1.4.3 精子頂體完整率檢測

采用考馬斯亮藍(lán)法檢查精子頂體完整率。取37 ℃生理鹽水0.5 mL，加入100 μL精液，10 000 rmin 離心15 s，棄上清；加入0.5 mL多聚甲醛，靜置30 min后用PBS離心洗滌2次，使用50 μL PBS重懸后取10 μL樣品滴于載玻片上，制成涂片。晾干后用考馬斯亮藍(lán)染液滴染涂片，靜置30 min。風(fēng)干后于油鏡下觀察頂體完整情況，頂體區(qū)為紫藍(lán)色的表示頂體完整，頂體區(qū)未染色或淡藍(lán)色為頂體不完整[10]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”(Mean±SEM)，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋液的選擇

如表2所示，42 ℃解凍17 s時，7號稀釋液處理的精子活率(42.97%)最高，5號(39.60%)次之，1號(10.37%)最低，其中7號稀釋液處理組與其他各組差異顯著。70℃解凍5 s時，7號活率(50.62%)最高，5號(43.47%)次之，1號(17.11%)最低，其中7號稀釋液處理組亦為與其他各組差異顯著。

42℃解凍17 s處理下，7號稀釋液處理組的活力是39.79%，顯著高于其他各組；5號和6號次之，二者差異不顯著；1號和2號稀釋液保存解凍后精子活力最差。70℃解凍5 s處理下，7號稀釋液處理組的活力是43.09%，顯著高于其他各組；5號(33.47%)次之，1號稀釋液處理后精子活力最差(12.06%)。

42 ℃解凍17 s條件下，6號和7號稀釋液解凍后精子質(zhì)膜完整率分別為38.33%和39.39%，顯著高于1—5號稀釋液。70℃解凍5 s條件下，7號稀釋液解凍后精子質(zhì)膜完整率為40.09%，6號(33.41%)次之，2號(13.07%)最差，其中7號稀釋液質(zhì)膜完整率顯著高于其他各組。

在兩種解凍條件下，7號稀釋液的頂體完整率均最高，分別達(dá)53.49%和54.37%，顯著高于其他各稀釋液組的頂體完整率。1號稀釋液的頂體完整率最差，分別為16.33%和15.27%。

表2 不同稀釋液處理對精子解凍后性能的影響

注：同列不同字母代表差異顯著(P<0.05)

2.2 不同解凍溫度-時間的選擇

以7號稀釋液為冷凍稀釋液，比較不同解凍溫度和時間對湖羊凍精的影響。如表3所示，不同解凍條件下，70 ℃ 5 s解凍時精子活率和活力分別為50.62%和43.09%，顯著高于其他各組。70 ℃ 5 s、42 ℃ 17 s解凍條件下，精子的質(zhì)膜完整率(分別為40.09%和39.39%)和頂體完整率(分別為54.37%和53.49%)均顯著高于其他各組，但兩者之間沒有顯著差異。

表3 不同解凍條件對解凍后精子質(zhì)量的影響

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

本研究中，7號稀釋液無論是從解凍后精子活率活力上，還是從質(zhì)膜和頂體完整率上，其總體效果均優(yōu)于其他各組。在精液冷凍過程中，精液稀釋液的滲透壓和精漿一致，可以避免精子質(zhì)膜因滲透壓變化引起的損傷[11]。精液稀釋液的最佳滲透液壓范圍為300—350 mOsmmL。本試驗(yàn)中7號稀釋液的滲透壓為317 mOsmmL，處于最佳范圍內(nèi)。

目前稀釋液配方中多添加葡萄糖、果糖和蔗糖。葡萄糖為醛糖，是最易被細(xì)胞吸收而且最穩(wěn)定的單糖；果糖為酮糖，與葡萄糖是同分異構(gòu)體。蔗糖為二糖，由葡萄糖和果糖脫水縮合而成，其化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，在熱、冷、酸、堿等環(huán)境下會發(fā)生改變，化學(xué)結(jié)構(gòu)易被破壞[12]。本試驗(yàn)中僅添加蔗糖的1號稀釋液效果最差，其次是2號和3號稀釋液，4號、5號和6號與7號稀釋液相比，效果略差，這可能是由于7號稀釋液中添加的葡萄糖，一方面可以保持精子所需滲透壓[13]，另一方面可以快速補(bǔ)充精子所需能量，維持細(xì)胞代謝所需，使精子存活時間得到延長，受精能力得以提升[14-15]。另外，檸檬酸作為常規(guī)稀釋液添加物[16]，是pH緩沖物質(zhì)，本試驗(yàn)中精子解凍后質(zhì)量明顯優(yōu)于添加二水檸檬酸鈉。7號和6號稀釋液的冷凍效果優(yōu)于4號和5號，推測出檸檬酸的最優(yōu)質(zhì)量濃度在0.16—0.18gL。

冷凍精子的解凍過程直接影響著凍精的效果，其中解凍時間和解凍溫度這兩點(diǎn)對于解凍過程來說至關(guān)重要[17]。以往日本、法國和英國等國家大部分使用5℃長時間緩慢解凍，澳大利亞、芬蘭、比利時、瑞典和新西蘭等采用15℃解凍，比利時、匈牙利和前蘇聯(lián)等大部分國家選擇37—42℃快速解凍，挪威等少數(shù)國家則選擇75℃左右高溫超快速解凍，包括中國在內(nèi)的多數(shù)國家均采用35—40℃進(jìn)行精液的解凍[18]。而精液溫度在-5—-25 ℃為危險(xiǎn)溫度帶，精液易形成小冰晶，會對精子造成不可逆的物理損傷和化學(xué)損傷，而細(xì)管快速通過危險(xiǎn)溫度帶能避免損傷[19-20]，同時，由于精液中的酶活性不穩(wěn)定，解凍時精液中的酶容易凝集精子[21]，本試驗(yàn)采用70℃高溫5s解凍時效果最好。宋新華等[22]在牛精子解凍時采用75℃ 高溫4s解凍效果最佳，與本試驗(yàn)相似。然而，高溫解凍時間較短，需要準(zhǔn)確把握解凍時間。

綜上所述，7號稀釋液處理的精子各項(xiàng)指標(biāo)(活力、活率、質(zhì)膜完整率和頂體完整率)在不同解凍溫度下均最高。本研究中使用7號稀釋液進(jìn)行冷凍，解凍時采用70 ℃解凍5 s效率最佳。