?；勖?，楊敬東，田少君

(1.河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州450001； 2.蘭州潤民糧油有限公司，蘭州730070)

米糠蛋白中含3%～4%賴氨酸，高于水稻胚乳蛋白或其他谷物蛋白或豆類蛋白，生物效價(jià)(2.0～2.5)與牛奶中酪蛋白(2.5)相近，易于消化，不易致敏[1-2]，還具有降低膽固醇、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗疲勞和抗癌等作用。但是米糠蛋白與其他物質(zhì)(如糖類，脂類)的強(qiáng)烈聚合，分子間通過大量的二硫鍵交聯(lián)使得其溶解性差，進(jìn)而影響其他功能特性。因此，需要采用改性技術(shù)提高米糠蛋白功能特性。

蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物是含有若干種氨基酸的小分子肽，具有較好的功能特性，而且其產(chǎn)品具備更高的營養(yǎng)價(jià)值。Zhang等[3]研究了堿性蛋白酶酶解經(jīng)過高溫穩(wěn)定化及脫脂處理的米糠蛋白，Yeom等[4]研究了用兩種混合酶(堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶)酶解米糠蛋白。這些措施都顯著提高了米糠蛋白功能性。但是對(duì)于木瓜蛋白酶酶解米糠蛋白的研究少有報(bào)道。木瓜蛋白酶是最便宜的植物來源蛋白酶之一，而且已經(jīng)通過FDA批準(zhǔn)可用于食品配方和食品加工中。木瓜蛋白酶主要作用于蛋白質(zhì)親水氨基酸賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和苯丙氨酸(Phe)的羧基端，這樣可以避免C—末端為疏水性氨基酸的苦味肽的產(chǎn)生。然而，傳統(tǒng)的酶解具有水解度低和反應(yīng)時(shí)間長的缺點(diǎn)[5]，因此許多研究采用超聲處理來促進(jìn)酶解反應(yīng)。超聲波產(chǎn)生的空化作用所引起的機(jī)械和熱效應(yīng)，可以改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象和特性，從而有利于增加底物與酶之間的接觸頻率[6]，縮短酶反應(yīng)時(shí)間。Li等[7]的研究顯示，超聲預(yù)處理大米蛋白可以提高堿性蛋白酶酶解反應(yīng)速率和蛋白質(zhì)水解度。

本研究首先利用超聲對(duì)米糠蛋白進(jìn)行預(yù)處理，破壞蛋白空間結(jié)構(gòu)，暴露出更多的酶作用位點(diǎn)，再進(jìn)行限制性酶解，改善米糠蛋白溶解性和乳化性。并從改性前后米糠蛋白二硫鍵、表面疏水性和二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律中，分析超聲輔助酶解反應(yīng)的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新鮮米糠，河南新鄉(xiāng)八素米業(yè)有限公司；大豆油，山東萬德福實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；木瓜蛋白酶(60萬U/g)，南寧龐博生物工程有限公司；其他試劑均為化學(xué)純或分析純。

K1160全自動(dòng)凱氏定氮儀；高速剪切乳化機(jī)，德國 FLUKO流體機(jī)械制造公司；磁力攪拌器；恒溫水浴振蕩器；高速離心機(jī)；722S可見分光光度計(jì)；PHS-3C 型精密酸度計(jì)；LGJ-25型冷凍干燥機(jī)；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)；傅里葉紅外光譜儀；RF-5301熒光分光光度計(jì)，日本Shimadzu公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 米糠蛋白的制備

將脫脂米糠以料液比1∶10加入蒸餾水→45℃下調(diào)pH至9.0→磁力攪拌2 h后離心20 min(4 500 r/min)→取上清液，調(diào)pH至4.5→離心20 min (4 500 r/min)后收集沉淀→用20%乙醇溶液洗兩次后離心→沉淀復(fù)溶，調(diào)pH到7.0→冷凍干燥→米糠蛋白。米糠蛋白存放于-20℃?zhèn)溆?。?jīng)凱氏定氮法測定其蛋白質(zhì)含量為(60.35±0.31)%。

1.2.2 超聲輔助酶改性米糠蛋白

米糠蛋白溶液在超聲功率密度5 W/mL，超聲時(shí)間30 min，蛋白質(zhì)量濃度4 g/100 mL條件下進(jìn)行預(yù)處理，然后調(diào)節(jié)pH、溫度，添加一定量的木瓜蛋白酶反應(yīng)一定時(shí)間，在反應(yīng)過程中分別用0.1 mol/L NaOH和HCl溶液維持pH恒定，反應(yīng)結(jié)束后置于85℃水浴中10 min進(jìn)行滅酶，冷卻后得酶解液, 一部分使用蒸餾水稀釋至質(zhì)量濃度為1 g/100 mL，測定其水解度(DH)、溶解性和乳化性，另一部分經(jīng)過冷凍干燥用于結(jié)構(gòu)的測定。

1.2.3 水解性的測定[8]

采用茚三酮比色法測定，計(jì)算公式見式(1)。

DH=酶解后游離氮含量/酶解前游離氮含量×100%

(1)

1.2.4 溶解性的測定[4]

用移液槍吸取1.2.2中10 mL酶解液于燒杯中，調(diào)節(jié)pH為7.0，室溫下磁力攪拌1 h，在4 500 r/min下離心20 min。吸取4 mL上清液，用半微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量，按式(2)計(jì)算溶解性。

溶解性=水溶性氮含量/樣品總氮含量×100%

(2)

1.2.5 乳化性的測定[9]

用移液槍吸取1.2.2中18 mL酶解液于50 mL離心管中，調(diào)節(jié)pH為8.0，室溫下磁力攪拌1 h，在4 000 r/min下離心8 min后，加入6 mL大豆油，使用10 000 r/min的均質(zhì)剪切機(jī)剪切1 min，立即從容器底部吸50 μL新鮮乳液，用0.1 g/100 mL SDS溶液稀釋100倍，立即于500 nm波長下測吸光值(A0)，10 min后繼續(xù)測吸光值(A10)，乳化活性指數(shù)和乳化穩(wěn)定性分別按式(3)和式(4)計(jì)算。

EAI=2×2.303×A0×N/(C×φ×10 000)

(3)

ESI=A0/(A0-A10)×10

(4)

式中：EAI為乳化活性指數(shù)，m2/g;N為稀釋倍數(shù) 100；C為乳液形成前蛋白溶液中蛋白質(zhì)量濃度, g/mL；φ為乳液中油的體積分?jǐn)?shù)，取值0.25；ESI為乳化穩(wěn)定性，min。

1.2.6 游離巰基二硫鍵的測定[10]

采用 5，5′-二硫代二硝基苯甲酸鹽比色法測定米糠蛋白總巰基和游離巰基含量，以13 600 mol/(L·cm)消光系數(shù)進(jìn)行計(jì)算?？値€基與游離巰基差值的一半即為二硫鍵含量。

1.2.7 表面疏水性的測定[10]

取100 mg米糠蛋白溶解于0.01 mol/L pH 7磷酸鹽緩沖液中，室溫下磁力攪拌2 h后5 000 r/min離心20 min，收集上清液。用磷酸鹽緩沖液將蛋白質(zhì)量濃度稀釋在0.005～0.5 mg/mL之間。取4 mL蛋白溶液，加入20 μL 0. 008 mol/L 1-苯氨基萘-8-磺酸，混合均勻，在激發(fā)波長390 nm和發(fā)射波長470 nm下測定熒光強(qiáng)度。以熒光強(qiáng)度對(duì)蛋白質(zhì)量濃度作圖，采用最小二乘法進(jìn)行曲線擬合，直線斜率即為蛋白的表面疏水性。

1.2.8 傅里葉紅外光譜分析

取2 mg米糠蛋白和200 mg KBr混合，研磨均勻后制作透明薄片，以純KBr為參照樣，室溫干燥環(huán)境進(jìn)行傅里葉紅外光譜掃描，掃描范圍400～4 000 cm-1。

對(duì)米糠蛋白的紅外吸收曲線進(jìn)行二級(jí)求導(dǎo)，光譜數(shù)據(jù)用Peakfit4.12軟件進(jìn)行分析。參考Wang等[11]的方法對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定：α-螺旋結(jié)構(gòu)，1 650 ～1 658 cm-1；β-折疊結(jié)構(gòu)，1 600～1 640 cm-1；β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，1 660～1 700 cm-1；無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，1 640～1 650 cm-1。

1.2.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

單項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。采用IBM SPSS Statistics 20軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，如果方差分析差異性顯著(P<0.05)，則使用Duncan’s進(jìn)行多重比較。采用Origin8.5軟件進(jìn)行圖表制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲預(yù)處理對(duì)酶解米糠蛋白水解度的影響

在預(yù)處理中，以乳化性和溶解性為指標(biāo)，對(duì)米糠蛋白進(jìn)行超聲改性，確定了最佳超聲條件為：超聲功率密度5 W/mL，超聲時(shí)間30 min，蛋白質(zhì)量濃度4 g/100 mL。經(jīng)超聲預(yù)處理的米糠蛋白再進(jìn)行限制性酶處理，固定酶解條件為酶添加量2.5 g/100 mL、pH 7、酶反應(yīng)溫度50℃，考察不同酶反應(yīng)時(shí)間下超聲預(yù)處理對(duì)米糠蛋白水解度的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)米糠蛋白水解度的影響

由圖1可知，在相同酶反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，與酶改性米糠蛋白相比，超聲輔助酶改性米糠蛋白具有較高水解度，表明超聲預(yù)處理促進(jìn)蛋白質(zhì)水解?？赡芤?yàn)槌暜a(chǎn)生的空化效應(yīng)有助于破壞溶質(zhì)-基質(zhì)間的相互作用，其中涉及范德華力、氫鍵和分子間的偶極子吸引力，使蛋白質(zhì)分子伸展，暴露出較多的酶作用位點(diǎn)。另外，適當(dāng)?shù)念A(yù)處理與酶解相結(jié)合,往往可以使酶解產(chǎn)物獲得更好的功能特性[12]。

2.2 超聲輔助木瓜蛋白酶改性米糠蛋白

在上述最佳超聲條件下，對(duì)米糠蛋白進(jìn)行預(yù)處理后，進(jìn)行酶改性處理，探討木瓜蛋白酶反應(yīng)條件對(duì)其溶解性和乳化性的影響。

2.2.1 酶添加量的影響

在酶反應(yīng)溫度50℃、pH 7、酶反應(yīng)時(shí)間3 h下，考察酶添加量對(duì)米糠蛋白溶解性和乳化性的影響，結(jié)果見圖2、圖3。

圖2 酶添加量對(duì)米糠蛋白溶解性的影響

圖3 酶添加量對(duì)米糠蛋白乳化性的影響

由圖2可知，酶添加量超過2.5 g/100 mL后米糠蛋白溶解性增加幅度不大。由圖3可知，隨著酶添加量的增加，米糠蛋白乳化活性先增大后減少，酶添加量2.5 g/100 mL時(shí)達(dá)到最大，乳化穩(wěn)定性則不斷升高。這可能因?yàn)槊柑砑恿吭龃?，蛋白質(zhì)分子與酶接觸頻率增加，進(jìn)而被水解成更多的小分子肽，而小分子肽能夠快速溶解并吸附在油水界面上，形成黏彈性保護(hù)膜，從而提高米糠蛋白的乳化活性。但當(dāng)酶添加量到一定程度后，小分子肽被分解為更低相對(duì)分子質(zhì)量的肽，它們可能不具有足夠的兩親性以表現(xiàn)出良好的乳化性質(zhì)[13]，使得乳化活性降低。而水解后的小分子肽增加了離子化基團(tuán)的數(shù)量和分布，在形成的乳狀液中液珠間吸引作用小于排斥作用，二者不易聚集，并且蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)外露，液珠中蛋白質(zhì)分子與油滴的吸引作用增強(qiáng)，乳化穩(wěn)定性提高[14]。雖然酶添加量較高時(shí)乳化穩(wěn)定性較好，但乳化活性降低，而且酶解成本增加。因此，選擇酶添加量2.5 g/100 mL。

2.2.2 酶反應(yīng)時(shí)間的影響

在酶反應(yīng)溫度50℃、pH 7、酶添加量2.5 g/100 mL下，考察酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)米糠蛋白溶解性和乳化性的影響，結(jié)果見圖4、圖5。

圖4 酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)米糠蛋白溶解性的影響

圖5 酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)米糠蛋白乳化性的影響

由圖4可知,酶解3 h后米糠蛋白溶解性增加不顯著。由圖5可知，當(dāng)酶反應(yīng)時(shí)間延長，米糠蛋白乳化活性先增大后減小，在3 h達(dá)到最大。而乳化穩(wěn)定性不斷升高。這與Bandyopadhyay等[9]研究結(jié)果一致?？紤]到酶反應(yīng)時(shí)間過長乳化活性降低及過度水解引起營養(yǎng)價(jià)值的改變[15]，選擇酶反應(yīng)時(shí)間3 h。

2.2.3 酶反應(yīng)pH的影響

在酶反應(yīng)溫度50℃、酶反應(yīng)時(shí)間3 h、酶添加量2.5 g/100 mL下，考察酶反應(yīng)pH對(duì)米糠蛋白溶解性和乳化性的影響，結(jié)果見圖6、圖7。

由圖6、圖7可知，米糠蛋白溶解性、乳化活性和乳化穩(wěn)定性在pH 5～7時(shí)增加，pH 7～8時(shí)降低。這可能因?yàn)樵谶m宜pH下，酶的活力最高，水解充分，二者達(dá)到最高。當(dāng)pH 8～9時(shí)米糠蛋白溶解性及乳化性出現(xiàn)了增大現(xiàn)象，可能因?yàn)槊卓返鞍自趬A性條件下發(fā)生了水解，提高了其溶解度和乳化性，但pH較高時(shí)會(huì)破壞或改變必需氨基酸，降低蛋白質(zhì)的質(zhì)量[4]。因此，選擇酶反應(yīng)pH 7。

圖6 酶反應(yīng)pH對(duì)米糠蛋白溶解性的影響

圖7 酶反應(yīng)pH對(duì)米糠蛋白乳化性的影響

2.2.4 酶反應(yīng)溫度的影響

在酶反應(yīng)pH 7、酶添加量2.5 g/100 mL、酶反應(yīng)時(shí)間3 h下，考察酶反應(yīng)溫度對(duì)米糠蛋白溶解性和乳化性的影響，結(jié)果見圖8、圖9。

圖8 酶反應(yīng)溫度對(duì)米糠蛋白溶解性的影響

圖9 酶反應(yīng)溫度對(duì)米糠蛋白乳化性的影響

由圖8可知，在酶反應(yīng)溫度范圍內(nèi)米糠蛋白溶解性變化幅度不大。由圖9可知，米糠蛋白乳化活性在40～50℃時(shí)增加，50～55℃時(shí)降低。乳化穩(wěn)定性在40℃時(shí)最大，而55℃最小。這可能因?yàn)闇囟扔绊懥嗣富睢?5℃后繼續(xù)升高溫度，米糠蛋白的乳化活性及乳化穩(wěn)定性又有增高趨勢，可能因?yàn)槊卓返鞍桌锘煊械牡矸郯l(fā)生了糊化[4]，增加了液體的黏度，使得二者增高。雖在低溫下乳化穩(wěn)定性較高，考慮到溫度過低，酶活較弱，降低了乳化活性和延長了酶解時(shí)間，因此確定酶反應(yīng)溫度為50℃。

2.2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)米糠蛋白改性做綜合的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)共分為3組，各組的工藝參數(shù)見表1，并對(duì)比了改性前后米糠蛋白溶解性和乳化性，結(jié)果見表2。

表1 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)參數(shù)

注：超聲預(yù)處理參數(shù)為超聲時(shí)間30 min，超聲功率密度5 W/mL，蛋白質(zhì)量濃度4 g/100 mL。

表2 改性前后米糠蛋白溶解性和乳化性的對(duì)比

由表2可知，超聲輔助酶改性米糠蛋白溶解性比米糠蛋白提高了207.3%，可能因?yàn)槊卓返鞍字胁蝗苄缘鞍踪|(zhì)被酶解成可溶性小分子肽。乳化活性提高了54.94%，是由于米糠蛋白具有較低的表面疏水性，不利于其與脂質(zhì)之間的相互作用[16]，而酶解后，結(jié)構(gòu)展開，疏水基團(tuán)暴露于表面，提高了其在油水界面上的吸附作用，從而較易形成內(nèi)聚性膜。但乳化穩(wěn)定性降低了38.25%，可能因?yàn)槊卓返鞍妆凰獬尚》肿拥亩嚯?，不能較好地包裹在油滴表面，降低了蛋白膜的穩(wěn)固性[17]。但是，與酶改性米糠蛋白相比，超聲預(yù)處理使其溶解性、乳化活性及乳化穩(wěn)定性均有所提高。

2.3 改性前后米糠蛋白二硫鍵含量(見表3)

表3 改性前后米糠蛋白二硫鍵含量

二硫鍵對(duì)于維持蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)具有重要作用，其含量的增加表明蛋白質(zhì)發(fā)生了交聯(lián)，而含量減少表明蛋白質(zhì)主干結(jié)構(gòu)被破壞[18]。由表3可知，超聲改性米糠蛋白二硫鍵含量減小，這與Zhou[19]等研究超聲預(yù)處理小麥胚芽蛋白的結(jié)果一致?？赡芤?yàn)槌曇鸬募羟凶饔么偈沟鞍踪|(zhì)發(fā)生了去折疊。另外，超聲輔助酶改性米糠蛋白二硫鍵含量減小效果比單獨(dú)酶法改性明顯，可能因?yàn)槠涠嚯逆湼由煺梗M(jìn)而使更多的包埋于蛋白質(zhì)內(nèi)部的親水和疏水基團(tuán)暴露出來，提高了溶解度和乳化性。

2.4 改性前后米糠蛋白表面疏水性(見表4)

表4 改性前后米糠蛋白表面疏水性

由表4可知，超聲改性米糠蛋白表面疏水性增加，這與Jiang等[20]研究超聲處理黑豆蛋白的結(jié)果一致。表明更多的疏水區(qū)域暴露于蛋白表面，可能由于超聲打開蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而促使酶更容易作用于蛋白質(zhì)上，導(dǎo)致水解度提高，引起表面疏水性增加，促進(jìn)其在溶液中擴(kuò)散以及在油水界面上快速分布，增強(qiáng)乳化性，這與Cheetangdee[21]的研究結(jié)果一致。

2.5 改性前后米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化(見表5)

表5 改性前后米糠蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu) %

β-折疊和無規(guī)則卷曲含量增加，β-轉(zhuǎn)角含量下降，表明蛋白質(zhì)變得更加疏松與伸展[22]。從表5可知，超聲改性使米糠蛋白這種結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)而使得酶與蛋白質(zhì)分子更易于接近，從而提高酶解程度，促使溶解性增大。同時(shí)蛋白酶解后形成的小分子肽會(huì)促進(jìn)α-螺旋結(jié)構(gòu)向無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變，無規(guī)則卷曲可以為蛋白質(zhì)分子提供柔性結(jié)構(gòu)單元。而柔性越大，乳化性越好[23]。

3 結(jié) 論

米糠蛋白在超聲功率密度5 W/mL、超聲時(shí)間30 min、蛋白質(zhì)量濃度4 g/100 mL條件下預(yù)處理后，進(jìn)行酶解反應(yīng)，當(dāng)酶添加量2.5 g/100 mL、酶反應(yīng)時(shí)間3 h、pH 7、酶反應(yīng)溫度50℃時(shí)，超聲輔助酶改性米糠蛋白溶解性為89.61%，比未改性的提高了207.3%，乳化活性指數(shù)為19.29 m2/g，比未改性的提高了54.94%，乳化穩(wěn)定性為50.00 min，比未改性的降低了38.25%。由于超聲促進(jìn)酶催化位點(diǎn)暴露，所以與酶改性米糠蛋白相比，超聲輔助酶改性米糠蛋白的溶解性和乳化性均得到提高。

米糠蛋白經(jīng)超聲輔助酶改性后，二硫鍵含量減少，表明蛋白質(zhì)多肽鏈得到伸展，表面疏水性升高。β-折疊和無規(guī)則卷曲含量增大，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角含量減小，說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生伸展和重組，分子柔性增強(qiáng)。這些結(jié)構(gòu)上的變化，改善了米糠蛋白的溶解性和乳化性。