趙晨偉，王 勇，李明祺，李 明，李 磊，金青哲

(1.江南大學(xué) 食品學(xué)院, 江蘇 無錫 214122； 2.豐益(上海)生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司，上海 200137；3.諾維信(中國)生物技術(shù)有限公司，北京 100085)

米糠油又稱稻米油，受米糠生產(chǎn)企業(yè)運(yùn)輸存放條件的限制，現(xiàn)階段國內(nèi)米糠毛油酸價(jià)(KOH)普遍在20 mg/g左右，有的甚至高達(dá)40 mg/g以上[1]。

高酸價(jià)米糠毛油若采用傳統(tǒng)堿煉脫酸，一般每個(gè)酸價(jià)的煉耗達(dá)1.2%，精煉率低，且能耗高，排放大。同時(shí)，米糠毛油中的有益物質(zhì)谷維素在堿煉過程中大部分損失，生育三烯酚也會遭到破壞，從而降低米糠油的品質(zhì)[2]。采用物理精煉脫酸，煉耗能降到0.55%～0.6%，但物理精煉對毛油預(yù)處理要求非常嚴(yán)格，常規(guī)脫膠處理難以完全脫除米糠毛油中的膠質(zhì)，導(dǎo)致物理精煉油的口感與色澤較差，還可能產(chǎn)生聚合物和反式脂肪酸等風(fēng)險(xiǎn)因子[3]。

酶法脫酸是近年發(fā)展起來的新型油脂脫酸方法[4-13]，是利用脂肪酶催化毛油中的游離脂肪酸與酰基受體發(fā)生酯化反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)變?yōu)轷?，達(dá)到脫酸目的，同時(shí)提高油脂得率[14]。相較于傳統(tǒng)的化學(xué)堿煉脫酸和物理精煉脫酸方法，酶法脫酸具有油脂損耗低、成品油品質(zhì)優(yōu)、有益物質(zhì)保留率高、能耗低、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)[4]。本文以米糠毛油為原料，采用固定化脂肪酶CALB進(jìn)行酶法脫酸工藝優(yōu)化研究，旨在尋求較優(yōu)的米糠毛油精煉方法，達(dá)到多出油，出好油，提高稻米資源利用率和增值效益的目的。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

米糠毛油，秦皇島金海食品工業(yè)有限公司提供，已經(jīng)脫膠處理，酸價(jià)(KOH)20.52 mg/g(游離脂肪酸含量10.26%)，甘一酯含量1.58%,甘二酯含量7.52%。固定化脂肪酶CALB，諾維信中國有限公司提供。甘油、無水乙醇、甘一酯、甘二酯等試劑均為分析純。

高速剪切機(jī)，循環(huán)水式真空泵，HH-2數(shù)顯電子恒溫水浴鍋，TG18G臺式高速離心機(jī)，BT-9300H激光粒度分布儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 米糠毛油酶法脫酸

稱取一定量米糠毛油于三口燒瓶中，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至6附近，加入反應(yīng)所需的不同?；荏w，添加量以酰基受體與游離脂肪酸摩爾比計(jì)，并剪切混合，之后加入一定量的固定化脂肪酶 CALB在一定溫度下反應(yīng)，反應(yīng)過程通氮?dú)?，并維持體系真空度小于1 000 Pa，反應(yīng)一定時(shí)間后，將反應(yīng)物取出，10 000 r/min離心10 min后收集上層油相測定酸價(jià)，并計(jì)算酯化率。

酯化率=(AV0-AV1)/AV0×100%

式中：AV0、AV1分別為酯化前后油脂酸價(jià)。

1.2.2 酸價(jià)的測定

酸價(jià)測定按照GB 5009.229—2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中酸價(jià)的測定》執(zhí)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 酰基受體對酯化率的影響

?；荏w是分子上有羥基并可與游離脂肪酸的羧基發(fā)生酯化反應(yīng)的化合物[15]。?；荏w可以是內(nèi)源的，也可以是外加的，米糠毛油中存在的內(nèi)源的?；荏w有甘一酯、甘二酯、甾醇等。

在反應(yīng)物中添加不同的?；荏w，酰基受體添加量與游離脂肪酸的摩爾比均為1∶3，之后進(jìn)行剪切混合，剪切速度25 m/s，剪切時(shí)間20 min，之后加酶進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)在反應(yīng)裝置底部通入氮?dú)猓瑫r(shí)抽真空，維持真空度小于1 000 Pa，反應(yīng)溫度60℃，加酶量50 g/kg，反應(yīng)時(shí)間6 h，測定米糠毛油的酯化率，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，這幾種?；荏w由于所含羥基數(shù)目、空間結(jié)構(gòu)、溶解度不同，酯化率差異較大，甘油的酯化率比甘二酯、甘一酯略高，這主要是由于甘油的空間位阻較小，米糠毛油中的游離脂肪酸易與甘油結(jié)合形成酯類[5]。

同時(shí)不加?；荏w的對照組的酯化率達(dá)到了55%，說明米糠毛油中存在的內(nèi)源的?；荏w可以與游離脂肪酸發(fā)生反應(yīng)，明顯降低米糠毛油酸價(jià)。因此，對于酸價(jià)不高的米糠毛油，可以不外加酰基受體而利用內(nèi)源?；荏w達(dá)到酯化脫酸目的。相對于不加酰基受體的對照組，添加酰基受體的酯化率有明顯的提高。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中用甘油作為?；荏w。

圖1 ?；荏w對酯化率的影響

2.2 通氮?dú)鈱︴セ实挠绊?/h3>

酶法脫酸原理是酯化反應(yīng)，反應(yīng)生成物是甘油酯和水。該反應(yīng)是可逆反應(yīng)，為了打破酯化反應(yīng)平衡，使反應(yīng)往酯化方向繼續(xù)進(jìn)行，關(guān)鍵是將反應(yīng)產(chǎn)生的水去除。為此在反應(yīng)過程中由底部通入氮?dú)?，同時(shí)抽真空，維持真空度小于1 000 Pa，在甘油與游離脂肪酸摩爾比1∶3，剪切速度25 m/s,剪切時(shí)間20 min，反應(yīng)溫度60℃，加酶量50 g/kg條件下，反應(yīng)不同時(shí)間后測定酯化率，結(jié)果見圖2。

圖2 通氮?dú)鈱︴セ实挠绊?/p>

由圖2可知，抽真空同時(shí)通入氮?dú)猓梢悦黠@提高酯化率，這是由于氮?dú)庖环矫婵梢栽鰪?qiáng)攪拌，促進(jìn)兩種底物的接觸；另一方面氮?dú)庠诒徽婵粘殡x的同時(shí)也降低了整個(gè)體系的蒸汽分配壓，起到了蒸餾的作用，使得反應(yīng)生成的水快速汽化分離，從而加速了酯化反應(yīng)向右進(jìn)行，提高酯化率。因此，實(shí)驗(yàn)選擇抽真空同時(shí)通入氮?dú)?，維持真空度小于1 000 Pa。

2.3 高速剪切對酯化率的影響

酯化反應(yīng)時(shí)兩種底物即甘油和油脂并不互溶，需將兩種底物充分混合以增大正向反應(yīng)速率。因此，需研究甘油分散粒徑對反應(yīng)的影響。取米糠毛油，加入所需甘油，進(jìn)行剪切混合，控制剪切速度為25 m/s，剪切時(shí)間分別為3、5、20 min。取樣品，靜置24 h后，通過激光粒度分布儀檢測甘油粒徑，分別得到甘油的分散粒徑為大于15 μm、5～15 μm、小于1 μm。分別對不同粒徑的體系在甘油與游離脂肪酸摩爾比1∶3，反應(yīng)溫度60℃，加酶量50 g/kg，抽真空同時(shí)通入氮?dú)?，維持真空度小于1 000 Pa條件下反應(yīng)不同時(shí)間后測定酯化率，結(jié)果見圖3。

圖3 高速剪切對酯化率的影響

由圖3可知，甘油粒徑相同時(shí)，酯化率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長呈現(xiàn)上升趨勢，而隨著甘油粒徑的減小，相同反應(yīng)時(shí)間內(nèi)酯化率顯著提高。當(dāng)甘油粒徑小于1 μm時(shí)，反應(yīng)6 h，酯化率達(dá)到88%。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用先將甘油高速剪切后再反應(yīng)。剪切條件為剪切速度25 m/s，剪切時(shí)間20 min。

2.4 加酶量對酯化率的影響

在甘油與游離脂肪酸摩爾比1∶3，剪切速度25 m/s，剪切時(shí)間20 min，反應(yīng)溫度60℃，反應(yīng)時(shí)間6 h，抽真空同時(shí)通入氮?dú)?，維持真空度小于1 000 Pa，添加不同量的脂肪酶，反應(yīng)后測定酯化率，結(jié)果見圖4。

圖4 加酶量對酯化率的影響

由圖4可知，酯化率隨著加酶量的增加而增加，當(dāng)加酶量達(dá)到50 g/kg以后，增大加酶量對酯化率的影響較小。原因是：在機(jī)械攪拌下，反應(yīng)體系所形成的界面面積是一定的，只能容納有限的酶與底物在此結(jié)合，當(dāng)界面面積被酶和底物飽和后，再增大加酶量，對酯化效果的影響不大；其次，加酶量過多，可能會引起酶在反應(yīng)界面聚集，從而降低反應(yīng)體系的有效界面面積。因此，綜合考慮酯化效率與成本，確定最適加酶量為50 g/kg。

2.5 反應(yīng)時(shí)間對酯化率的影響

在甘油與游離脂肪酸摩爾比1∶3，剪切速度25 m/s，剪切時(shí)間20 min，反應(yīng)溫度60℃，加酶量50 g/kg，抽真空同時(shí)通入氮?dú)猓S持真空度小于1 000 Pa的條件下，反應(yīng)不同時(shí)間后測定酯化率，結(jié)果見圖5。

圖5 反應(yīng)時(shí)間對酯化率的影響

為了能夠達(dá)到合適的催化效果，延長反應(yīng)時(shí)間是常用手段之一。但反應(yīng)時(shí)間過長會影響酶的回收與再催化活性，影響生產(chǎn)效率。由圖5可知，在反應(yīng)初期，酯化率隨反應(yīng)時(shí)間延長而增加，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為6 h時(shí)，酯化率為82.56%。超過6 h后，酯化率沒有明顯上升。反應(yīng)24 h時(shí)，酯化率為94.58%。相對于6 h的酯化率來說，反應(yīng)時(shí)間延長18 h，酯化率僅升高12.02個(gè)百分點(diǎn)，長時(shí)間反應(yīng)并未明顯提高酯化率，所以反應(yīng)時(shí)間為6 h最佳。

2.6 反應(yīng)溫度對酯化率的影響

在甘油與游離脂肪酸摩爾比1∶3，剪切速度25 m/s，剪切時(shí)間20 min，加酶量50 g/kg，抽真空同時(shí)通入氮?dú)猓S持真空度小于1 000 Pa，反應(yīng)6 h，不同溫度反應(yīng)后測定酯化率，結(jié)果見圖6。

圖6 反應(yīng)溫度對酯化率的影響

由圖6可知，酯化率隨著反應(yīng)溫度升高呈先上升后降低的趨勢，這是因?yàn)殡S著反應(yīng)溫度上升脂肪酶的活力上升，能夠更有效地催化酯化反應(yīng)，但隨著反應(yīng)溫度進(jìn)一步上升，脂肪酶發(fā)生熱變性，活力下降，甚至失活，從而導(dǎo)致酯化率下降。當(dāng)反應(yīng)溫度為70℃時(shí)，酶促效果達(dá)到最大水平。因此，將最適溫度確定為70℃。

2.7 甘油中水分含量對酯化率的影響

在甘油與游離脂肪酸摩爾比1∶3，剪切速度25 m/s，剪切時(shí)間20 min，反應(yīng)溫度70℃，加酶量50 g/kg,反應(yīng)時(shí)間6 h,抽真空同時(shí)通入氮?dú)?，維持真空度小于1 000 Pa，甘油總量不變條件下添加不同量的水，反應(yīng)后測定酯化率，結(jié)果見圖7。

圖7 甘油中水分含量對酯化率的影響

甘油在分子結(jié)構(gòu)方面含有3個(gè)羥基，具有很強(qiáng)吸水性。而作為反應(yīng)底物的甘油在反應(yīng)過程中一直與酶直接接觸，純甘油會將脂肪酶發(fā)揮活性所需的水奪走，造成脂肪酶活性降低。由圖7可知，隨著甘油中水分含量增加，酯化率先增高后下降，甘油中水分含量為25%時(shí)，酯化率最高。這說明在甘油中水分含量為25%時(shí)，正好滿足脂肪酶所需活化水量，但隨著甘油中水分含量繼續(xù)增加，會使酯化反應(yīng)逆向進(jìn)行，導(dǎo)致酯化率下降。因此，最終選擇甘油中水分含量為25%。

2.8 最佳工藝條件的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

通過上述實(shí)驗(yàn)，確定最佳工藝條件為：甘油與游離脂肪酸摩爾比1∶3,剪切速度25 m/s，剪切時(shí)間20 min，加酶量50 g/kg，反應(yīng)溫度70℃，反應(yīng)時(shí)間6 h，甘油中水分含量25%，真空度小于1 000 Pa，通氮?dú)?。在最佳工藝條件下，米糠毛油酸價(jià)(KOH)從20.52 mg/g降至1.54 mg/g，酯化率可達(dá)92.5%。

3 結(jié) 論

研究了固定化脂肪酶 CALB對米糠毛油的酶法脫酸工藝條件。結(jié)果表明，最佳反應(yīng)條件為：甘油與游離脂肪酸摩爾比1∶3，剪切速度25 m/s，剪切時(shí)間20 min，加酶量50 g/kg，反應(yīng)溫度70℃，反應(yīng)時(shí)間6 h，甘油中水分含量25%，真空度小于1 000 Pa，通氮?dú)?。在最佳工藝條件下，米糠毛油的酯化率達(dá)到92.5%。