袁錦瑩, 孫萬(wàn)成, 羅毅皓， 謝鳳蓮

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

青海特殊的高原氣候賦予了牦牛乳高于普通牛乳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。牦牛乳的脂肪和蛋白質(zhì)的含量較普通牛乳高。牦牛乳的乳脂率平均達(dá)7.5%，高于普通牛乳，蛋白質(zhì)含量平均達(dá)5.2%，也高于普通牛乳，且干物質(zhì)總量也高于普通牛乳[1]。牦牛乳是一種高脂高蛋白的天然濃縮乳，是乳制品加工和制作的優(yōu)良原料乳[2-4]。

青海牦牛是生長(zhǎng)在青藏高原地區(qū)的一種稀有牛種，這里海拔高，氣候寒冷，因此造就了牦牛不同于普通牛種的獨(dú)特體質(zhì)，牦牛肉脂肪含量不高，并含有大量的營(yíng)養(yǎng)成分和豐富的微量元素，特別是含有人體必需的脂肪酸，對(duì)人體的健康是非常重要的[5-8]。加之它們常年以這一地區(qū)的天然牧草為食，所產(chǎn)的牦牛奶具有獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)[9]。

在脂肪組織中，脂肪生成相關(guān)基因的表達(dá)水平受到許多轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[10]。有研究指出，甾醇類(lèi)調(diào)控元件結(jié)合蛋白(SREBP)是一種核轉(zhuǎn)錄因子，在酯類(lèi)合成中，尤其是在固醇類(lèi)和脂肪酸合成中起到重要作用[11]。SREBP是物體內(nèi)脂肪合成的一個(gè)極重要的調(diào)節(jié)因子，通過(guò)調(diào)節(jié)動(dòng)物體內(nèi)與脂肪生成相關(guān)的酶(生脂酶)的基因轉(zhuǎn)錄水平而調(diào)節(jié)這些酶的活性，從而控制體內(nèi)脂肪合成。

已有研究證明，SREBP-1是哺乳動(dòng)物肝臟脂肪生成基因的主要調(diào)節(jié)者，能調(diào)節(jié)脂肪酸、甘油三酯和膽固醇合成的30多個(gè)基因的表達(dá)[12]。也有研究證實(shí)，SREBP-1是脂肪酸合成相關(guān)酶基因的上游調(diào)節(jié)元件[13]。金世杰等[14]研究者在對(duì)黃牛中SCD1與SREBP-1的協(xié)同表達(dá)研究后發(fā)現(xiàn)，SREBP-1可激活SCD1脂肪酸合成酶，導(dǎo)致脂肪酸合成增加，造成肝臟脂質(zhì)蓄積。

青海是全國(guó)五大牧區(qū)之一，是牦牛的主要產(chǎn)區(qū)，目前全省有牦牛約500萬(wàn)頭。牦牛是青海的特色，具有其獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。而關(guān)于改善青海牦牛肉品質(zhì)的研究鮮有報(bào)道，為此，本研究采集青海省不同地區(qū)不同季節(jié)的牦牛結(jié)腸、腎臟和肝臟3種組織的樣品，提取Total RNA，在逆轉(zhuǎn)錄聚合酶的作用下生成cDNA,以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，利用Real-time PCR檢測(cè)牦牛甾醇類(lèi)調(diào)控元件結(jié)合蛋白1(SREBP-1)基因mRNA的表達(dá)水平，旨在為進(jìn)一步改善牛肉品質(zhì)提供可借鑒的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

采集不同季節(jié)不同地區(qū)的牦牛肝臟、腎臟和結(jié)腸，于凍存管中投入液氮罐保存?zhèn)溆?；RNAprep Pure Tissue Kit試劑盒，購(gòu)自天根生物科技(北京)有限公司；TaKaRa PrimeScript ? RT reagent Kit試劑盒，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；SYBR ?Premix Ex TaqTMⅡ，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；DNA聚合酶，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

低溫離心機(jī)(上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司)；AlphaTM Unit Block Assembly for DNA Engine ? System (BIO-RAD)；電泳儀BG-Power 300(BAYGENE BIOTECH COMPANY LIMITED)；凝膠成像分析儀WD-9413A(北京市六一儀器廠)；iQTM 5 Multicolor Real-time PCR Detection system(BIO-RAD)。

1.3 方 法

1.3.1 引物設(shè)計(jì) 引物(表1)是由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.3.2 牦牛肝臟、腎臟及總RNA的提取 使用RNAprep Pure Tissue Kit試劑盒分別從新鮮或超低溫凍存的肝臟樣品中提取總RNA，最后進(jìn)行RNA純度與濃度檢測(cè)，并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性。

1.3.3 RNA凝膠電泳 根據(jù)樣品量選擇合適大小的凝膠，表2中的配方可按相應(yīng)比例擴(kuò)大[15]。

表2 電泳膠配方

1.3.4 不同季節(jié)牦牛肝臟、腎臟及結(jié)腸cDNA的合成 cDNA的合成以從2015年春季祁連縣、2015年秋季大通縣、2016年春季湟中縣采集的牦牛肝臟、腎臟和結(jié)腸中提取的Total RNA為模板，按試劑盒推薦方法進(jìn)行操作。

1.3.5 不同季節(jié)牦牛不同組織的實(shí)時(shí)定量PCR 以合成的cDNA為模板，按試劑盒推薦方法進(jìn)行操作。

1.3.6 熒光定量PCR 按試劑盒推薦方法進(jìn)行操作，按表3中的組分配制反應(yīng)液(反應(yīng)液配制在冰上進(jìn)行)，熒光定量時(shí)，β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。

表3 熒光定量反應(yīng)液

1.3.7 統(tǒng)計(jì)方法 利用SPSS 16.0軟件分析統(tǒng)計(jì)組的差異性，采用最小顯著差數(shù)法，計(jì)量數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示脂肪酸差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取的RNA檢測(cè)

從RNA電泳圖(圖1)可以看出，上方的28S和下方18S條帶都很清晰，且28S約為18S條帶亮度的2倍，說(shuō)明提取的RNA完整性良好。

圖1 不同樣品RNA電泳圖

2.2 牦牛肝臟、腎臟及結(jié)腸SREBP-1基因cDNA的合成

圖2為由3個(gè)組織中提取的RNA反轉(zhuǎn)錄后擴(kuò)增的結(jié)果圖。利用在編碼區(qū)兩側(cè)設(shè)計(jì)的牦牛SREBP-1引物擴(kuò)增cDNA，獲得約150 bp的DNA片段。

圖2 樣品SREBP-1引物擴(kuò)增結(jié)果

2.3 SREBP-1基因PCR熒光定量

由圖3可以看出，SREBP-1基因在2015年春季祁連縣、2015年秋季大通縣和2016年春季湟中縣的熒光定量結(jié)果，溶解曲線只有1個(gè)峰，說(shuō)明其兩對(duì)引物的特異性強(qiáng)，沒(méi)有引物二聚體和非特異性產(chǎn)物，所以進(jìn)行熒光定量可以真實(shí)地反映出牦牛不同組織中引物mRNA的表達(dá)。

采用相對(duì)定量[16]，通過(guò)比較閾值法(2-ΔΔCt)進(jìn)行相對(duì)定量[17]。

Ct值是擴(kuò)增DNA的量達(dá)到閾值時(shí)候的循環(huán)次數(shù)[18]。由表4、表5和表6可以看出，Ct值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。

圖3 SREBP-1的溶解曲線分析

樣品牦牛SREBP引物反應(yīng)Ct值內(nèi)參β-actin反應(yīng)Ct值第1次第2次第3次平均值第1次第2次第3次平均值ΔCtΔCt平均值腎臟127.07 28.31 27.11 27.50±0.57519.7121.24 23.52 21.49±1.9196.01 腎臟227.53 27.50 27.62 27.55±0.06221.4320.66 20.10 20.73±0.6696.82 6.34腎臟328.37 28.10 28.10 28.19±0.15621.9421.17 22.89 22.00±0.7606.19 結(jié)腸128.54 26.86 26.37 27.26±1.06518.2718.41 18.40 18.36±0.0788.90 結(jié)腸229.15 29.34 29.04 29.18±0.14721.6421.18 21.11 21.31±0.2897.87 8.13結(jié)腸328.95 27.62 27.76 28.11±0.92520.5820.24 20.66 20.49±0.3177.62 肝臟126.19 26.48 25.28 25.98±0.75625.2924.42 23.42 24.38±0.9371.60 肝臟226.24 25.90 25.53 25.89±0.35320.7821.50 23.77 22.01±1.5643.88 1.90肝臟321.53 21.55 21.45 21.51±0.05321.5921.16 21.12 21.29±0.2600.22

表5 2015年秋季大通縣SREBP-1基因熒光定量

表6 2016年春季湟中縣SREBP-1基因熒光定量

將肝臟樣品作為對(duì)照樣品，將對(duì)照組的2-ΔΔCt值設(shè)為1進(jìn)行閾值比較。

根據(jù)公式：

2-ΔΔCt=

2-[(實(shí)驗(yàn)組SREBPCt-實(shí)驗(yàn)組β-ACTIN Ct)-(對(duì)照組SREBPCt-對(duì)照組β-ACTIN Ct)]

(1)

由公式(1)計(jì)算得，

表4，2015年春季：

腎臟，2-(6.34-1.90)=0.046

結(jié)腸，2-(8.13-1.90)=0.013

表5，2015年秋季：

腎臟，2-(6.93-4.70)=0.213

結(jié)腸，2-(6.72-4.70)=0.247

表6，2016年春季：

腎臟，2-(6.16-6.21)=1.035

結(jié)腸，2-(8.45-6.21)=0.212

由上述結(jié)果可以得出,SREBP-1 mRNA相對(duì)定量的拷貝數(shù)。

通過(guò)對(duì)SREBP-1的DNA重復(fù)3次進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)法，測(cè)出它們的平均ΔCt值，再根據(jù)比較閾值法進(jìn)行相對(duì)定量的結(jié)果。

由圖4可以看出，不同季節(jié)中除了2016年春季湟中縣的牦牛，其他的均以肝臟樣品中的SREBP-1 mRNA相對(duì)定量拷貝數(shù)最高。2015年春季祁連縣牦牛SREBP-1基因相對(duì)表達(dá)量由大到小為：肝臟、腎臟、結(jié)腸；2015年秋季大通縣牦牛SREBP-1基因相對(duì)表達(dá)量由大到小為：肝臟、結(jié)腸、腎臟；2016年春季湟中縣牦牛SREBP-1基因相對(duì)表達(dá)量由大到小為：腎臟、肝臟、結(jié)腸。

圖4 不同季節(jié)SREBP-1基因在牦牛不同組織中相對(duì)表達(dá)量

2.4 不同季節(jié)SREBP-1基因相對(duì)表達(dá)量相關(guān)性分析

從表7中可以看出，SREBP-1基因在2015年春季祁連縣和2016春季湟中縣中相對(duì)表達(dá)量差異極顯著，在2015年秋季大通縣和2016年春季湟中縣中相對(duì)表達(dá)量差異不顯著，并在2015年春季祁連縣和2015年秋季大通縣中相對(duì)表達(dá)量差異不顯著。

表7 3個(gè)季節(jié)SREBP-1相對(duì)表達(dá)量相關(guān)性分析

注：*表示差異顯著P<0.05，**表示差異極顯著P<0.01。下同。

2.5 SREBP-1基因在牦牛不同組織中的相對(duì)表達(dá)量

由圖5可以看出，牦牛不同組織中SREBP-1基因相對(duì)表達(dá)量由大到小順序?yàn)?，肝臟、腎臟、結(jié)腸。

圖5 SREBP-1基因在牦牛不同組織中的相對(duì)表達(dá)量

2.6 3個(gè)組織SREBP-1基因相對(duì)表達(dá)量相關(guān)性分析

從表8中可以看出，SREBP-1基因在結(jié)腸和肝臟中相對(duì)表達(dá)量差異極顯著，在腎臟和肝臟中相對(duì)達(dá)量差異顯著，而在結(jié)腸和腎臟中相對(duì)表達(dá)量差異則不顯著。

SREBP-1的作用主要包括調(diào)控脂肪細(xì)胞的分化，以及類(lèi)固醇和脂肪酸的合成過(guò)程。SREBP-1基因可以直接調(diào)節(jié)脂肪沉積，還可參與脂肪生成相關(guān)基因的表達(dá)水平的調(diào)控，間接調(diào)節(jié)脂肪的生成。目前對(duì)SREBP-1基因的研究也主要集中在豬、雞、兔上。例如，2001年，Gondret等使用Northern印跡法對(duì)SREBP-1 mRNA豬、雞、兔的組織中的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)分析，預(yù)測(cè)SREBP-1基因在肝臟和脂肪這兩種組織間相對(duì)表達(dá)量的高低[19]。

SREBP-1mRNA在兔的肝臟以及脂肪組織中從表達(dá)水平上看幾乎保持在一個(gè)水平，在雞的脂肪組織中SREBP-1 mRNA 的表達(dá)水平比在肝臟中低了近乎3倍左右[20]。除此之外，SREBP-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在脂肪代謝性疾病研究中起著重要的作用[21]。本研究檢測(cè)SREBP-1基因在牛的組織中的相對(duì)表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)SREBP-1 基因在青海牦牛的3個(gè)組織中均有表達(dá)，但在2015年春季祁連的牦牛結(jié)腸和腎臟中的表達(dá)均不高，其中，SREBP-1基因在2016年春季湟中的牦牛腎臟中表達(dá)最高。預(yù)測(cè)不同生長(zhǎng)環(huán)境和不同季節(jié)也會(huì)對(duì)SREBP-1基因的表達(dá)產(chǎn)生一定的影響。

表8 3個(gè)組織SREBP-1相對(duì)表達(dá)量相關(guān)性分析

3 結(jié) 論

青海牦牛不同組織中SREBP-1基因相對(duì)表達(dá)量為：肝臟>腎臟>結(jié)腸。3個(gè)組織中SREBP-1基因在結(jié)腸和肝臟中相對(duì)表達(dá)量差異極顯著，在腎臟和肝臟中相對(duì)表達(dá)量差異顯著，而在結(jié)腸和腎臟中相對(duì)表達(dá)量差異則不顯著。不同季節(jié)中除了2016年春季湟中縣的牦牛，其他的均以肝臟樣品中的SREBP-1 mRNA相對(duì)定量拷貝數(shù)最高。2015年春季祁連縣牦牛SREBP-1基因相對(duì)表達(dá)量由大到小為，肝臟、腎臟、結(jié)腸；2015年秋季大通縣牦牛SREBP-1基因相對(duì)表達(dá)量由大到小為，肝臟、結(jié)腸、腎臟；2016年春季湟中縣牦牛SREBP-1基因相對(duì)表達(dá)量由大到小為，腎臟、肝臟、結(jié)腸。

不同季節(jié)間SREBP-1基因在2015春季祁連縣和2016春季湟中縣中相對(duì)表達(dá)量差異極顯著，在2015年秋季大通縣和2016春季湟中，2015春季祁連縣和2015秋季大通縣中相對(duì)表達(dá)量差異則不顯著。