王曉銀，呂探宇，夏文姣，朱武凌，張會勇

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院生命科學技術學院，河南新鄉(xiāng) 453003)

惡性腫瘤的生長和轉移離不開營養(yǎng)供應[1]。目前，研究最多的與腫瘤血管生成相關的因子是血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)。VEGF被認為是一種最重要的促血管生成因子，其因mRNA的剪切形成VEGF121、145、148、165、183、189與206等7種主要亞型[2-4]。VEGF通過與其受體VEGFR1、VEGFR2和Nrp1結合，在腫瘤血管生成中發(fā)揮著重要的作用[4]。有研究表明，VEGF各亞型與Nrp1結合能力的不同導致在腫瘤中不同的招募[5-6]。單核細胞表達Nrp1(Nrp1-expressing monocytes,NEMs)以自分泌的方式在新生血管周圍招募平滑肌細胞促進血管成熟[7]。CD31是內皮細胞表面標志物，表示血管密度(microvessel density,MVD)[8]。α-smooth muscle actin(αSMA)是周細胞表面標志物[9]，表示周細胞數(shù)(pericyte number,PN)，而αSMA在CD31中所占的比例(PN/MVD)表示血管成熟度[10]。已有研究表明，VEGF189和VEGF165可以促進血管成熟度[11]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，過表達VEGF183(與VEGF189相比，在外顯子6a處少6個氨基酸)，可使瘤內微血管擴張[12]，但關于其對血管成熟度的影響，并未見相關研究報道。

本文主要研究穩(wěn)定過表達VEGF183的乳腺癌細胞株EMT-6在BALB/C小鼠皮內接種后，對腫瘤血管成熟度的影響，并與過表達VEGF165和VEGF189做比較?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞系 小鼠乳腺癌細胞株EMT-6購于美國ATCC公司，由本實驗通過脂質體穩(wěn)定轉染獲得轉染pcDNA3.1空載體的EMT-6細胞株，EMT-6-pcDNA3.1(EMT-6細胞組，作對照)，過表達VEGF189的EMT-6細胞株EMT-6-pcDNA3.1-VEGF189(EMT-6-189細胞組)，過表達VEGF183的EMT-6細胞株EMT-6-pcDNA3.1-VEGF183(EMT-6-183細胞組)和過表達VEGF165的EMT-6細胞株EMT-6-pcDNA3.1-VEGF165(EMT-6-165細胞組)細胞株(上述3種細胞株VEGF表達量接近)，保存于新鄉(xiāng)醫(yī)學院合成生物學工程實驗室(具體構建方法參考文獻[12])。

1.1.2主要試劑 DMEM高糖液體培養(yǎng)基購于美國HyClone公司，血清購于美國BI公司，0.25%的胰蛋白酶購于吉林省吉諾生物醫(yī)藥技術有限公司。一抗：CD31兔抗小鼠(批號50408-T16)購于北京義翹神州生物技術有限公司，工作液濃度1∶2 000稀釋；α-SMA兔單抗小鼠(批號ab32575)購于英國Abcam公司，工作液濃度1∶300稀釋；免疫組織化學SP試劑盒(兔鏈霉卵白素-生物素法檢測系統(tǒng)，批號SP-9001)、即用型DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋生物技術有限公司，其余化學試劑均為分析純級。

1.1.3實驗動物 雌性的6～8周齡的BALB/c小鼠(批次號11400700216964)購于北京維通利華實驗動物有限公司。本實驗中的實驗動物飼養(yǎng)與操作經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學院動物倫理學委員會批準。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 穩(wěn)定表達各VEGF亞型及載體的EMT-6細胞株于10%的胎牛血清與1%的雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置于含5% CO2的37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2樣本制備 12只BALB/C小鼠分為4組(EMT-6，EMT-6-189，EMT-6-183和EMT-6-165組)，每組3只。小鼠先腹部右側腋下脫毛，皮內接種 2.5×105個對應組細胞，待腫瘤長至直徑約為4～5 mm時，頸椎脫臼法處死小鼠，取出腫瘤。腫瘤組織經(jīng)4%多聚甲醛固定至少24 h，常規(guī)方法脫水透明浸蠟，石蠟包埋，石蠟切片機切片，厚度5 μm。

1.2.3免疫組織化學 石蠟切片經(jīng)脫蠟水化；抗原修復，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，每次3 min；3%的內源性過氧化氫阻斷劑阻斷，PBS洗3次，每次3 min；正常山羊血清封閉，吸去血清，一抗孵育，4 ℃過夜，PBS洗3次，每次3 min；滴加即用型生物素標記的山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，每次3 min；滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，每次3 min；DAB顯色；蘇木素復染；自來水返藍；脫水至透明；中性樹脂封片。

1.2.4檢測指標的定性與定量 DAB染色后，分別于低倍鏡下和高倍鏡下觀察，陽性反應呈棕黃色，CD31為內皮細胞膜陽性，α-SMA為周細胞胞質陽性。MVD計數(shù)：首先在100倍視野下選擇計數(shù)的部位，然后在400倍視野下計數(shù)CD31陽性的血管數(shù)，每張片子選擇5個不同的視野計數(shù)，計算平均值即為MVD；PN計數(shù)：與CD31計數(shù)原則一樣，先在100倍視野下選擇計數(shù)部位，再在400倍視野下計數(shù)α-SMA陽性周細胞數(shù)，隨機選擇5個不同的視野計數(shù)，計算平均值即為PN。

2 結 果

2.1各組間MVD的比較 免疫組織化學結果顯示，CD31陽性主要表達在瘤周，EMT-6-183、EMT-6-165、EMT-6-189組與EMT-6組比較，CD31的陽性血管數(shù)呈現(xiàn)遞增的趨勢；與EMT-6組比較，EMT-6-189、EMT-6-183組的血管形態(tài)不同，相較于對照組與VEGF165組，VEGF183與VEGF189誘導出現(xiàn)了較大比例擴張的腫瘤微血管，見圖1A～D。而定量分析瘤周MVD表明：EMT-6-183組MVD為4.6±1.1，EMT-6-165組的為4.8±0.8，EMT-6-189組為6.8±1.3，EMT-6組為22.8±4.8，EMT-6-165、EMT-6-183、EMT-6-189組瘤周MVD與EMT-6組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而EMT-6-165、EMT-6-183、EMT-6-189組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，圖1E。

A:EMT-6組DAB染色(×400)；B:EMT-6-189組DAB染色(×400)；C:EMT-6-183組DAB染色(×400)；D:EMT-6-165組DAB染色(×400)；E:MVD計數(shù)統(tǒng)計分析；a:P<0.01,與EMT-6組比較

圖1 各組間的MVD表達情況及分析

2.2各組間PN的比較 α-SMA陽性細胞定位在血管外周，且主要分布在瘤周，符合周細胞的組織學分布，α-SMA陽性細胞形成管腔樣微血管，見圖2A～D。而PN的定量分析結果顯示，EMT-6組PN為6.6±2.9，EMT-6-189組為2.4±0.5，EMT-6-165組為2.2±0.4，EMT-6-183組為1.8±0.4，EMT-6-165、EMT-6-183、EMT-6-189組與EMT-6組比較均顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而EMT-6-165、EMT-6-189、EMT-6-183組各組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖2E。

2.3各組間PN/MVD的比較 EMT-6-183組誘導了39.2%的血管成熟度，而EMT-6-165、EMT-6-189組分別誘導了46.0%和35.38%的成熟度。EMT-6組的血管成熟度只有31.8%。

A:EMT-6組DAB染色(×400)；B:EMT-6-189組DAB染色(×400)；C:EMT-6-183組DAB染色(×400)；D:EMT-6-165組DAB染色(×400)；E:PN計數(shù)統(tǒng)計分析；a:P<0.01,與EMT-6組比較

圖2 各組間的PN表達情況分析

3 討 論

從已存在的血管中生出新血管的過程被稱為血管新生[13]。這一過程發(fā)生在缺血性疾病、炎癥性疾病和惡性腫瘤中，被稱為病理性血管生成[14]。通過對腫瘤血管生成的認識，幫助我們了解腫瘤的生物學特征，從而促進開展個性化治療。血管計數(shù)是評估血管生成的“金標準”[15]，但在某些惡性腫瘤中，血管的數(shù)目不能準確地反應腫瘤的惡性程度及生長速度。研究證實，腫瘤內血管成熟對于腫瘤的供血發(fā)揮著重要的作用[16]。周細胞和內皮細胞是血管的重要組成成分，參與誘導血管新生，同時周細胞又通過和內皮細胞相互作用共同調節(jié)血管的形成、穩(wěn)定和重塑。

VEGF是已知的研究最多的促血管生長因子，本研究在EMT-6細胞株中分別穩(wěn)定轉入pcDNA3.1-VEGF189、pcDNA3.1-VEGF183、pcDNA3.1-VEGF165，皮內接種于BALB/c小鼠。結果表明，周細胞和內皮細胞在各組中均有表達，而在EMT-6組內，因有內源性的VEGF120及VEGF164(對應于人VEGF121與VEGF165)表達，內皮細胞數(shù)表達量較多，形成管腔狀較小的血管且主要集中在瘤周，所以其瘤周MVD相對較高。但因周細胞主要表達于血管外周，表達量較少，因此PN/MVD值較低。而過表達VEGF165，尤其是過表達VEGF183與VEGF189導致血管管腔擴大，而致使瘤周血管數(shù)目減少，即瘤周MVD相對EMT-6組少。過表達VEGF189、VEGF183和VEGF165的小鼠，PN和MVD值組內差距較小，但是PN/MVD值均高于EMT-6組，且過表達VEGF183的小鼠PN/MVD值介于過表達VEGF189和過表達VEGF165之間。已有研究表明VEGF189和VEGF165能夠促進血管成熟[11]，而VEGF183與VEGF189相比，結構上少了6個氨基酸，可能一定程度上影響其空間結構，使其與VEGFR1、VEGFR2和Nrp1的結合能力不同，導致對成熟度的影響不同。

本研究結果表明VEGF183與其他VEGF亞型均可促進血管成熟。腫瘤血管的成熟度直接影響化療及免疫藥物的運輸[17-18]，從而影響腫瘤治療效果。本研究可為未來依據(jù)VEGF表達的類型及血管成熟度進行腫瘤個體化治療提供一定的理論基礎。