（長春理工大學(xué) 光電工程學(xué)院，長春 130022）

在最新的調(diào)查報(bào)告中顯示，我國癌癥發(fā)病率近些年不斷攀升。目前，我國癌癥患者已超過全球患者的四分之一，每天爆增癌癥病例一萬人以上，隨著人口老齡化加重，癌癥的發(fā)病率還將不斷攀升。肝癌是死亡率最高的惡性腫瘤之一，因?yàn)楦伟┰缙诎Y狀不明顯，診斷觀察難度大，往往會(huì)貽誤病機(jī)，錯(cuò)過最佳的治療時(shí)間［1］?，F(xiàn)有的診斷方式往往是提取腫瘤組織直接進(jìn)行檢測，這種方法只能在病情將要甚至轉(zhuǎn)為惡性腫瘤時(shí)才能有所發(fā)現(xiàn)，面對(duì)我國目前肝癌患者增長趨勢，有效的檢測手段是必須而且有價(jià)值的［2］。

熒光分析法是根據(jù)物質(zhì)熒光譜線的位置及其強(qiáng)度進(jìn)行物質(zhì)鑒定和含量測定的分析方法。隨著對(duì)熒光光譜的觀察方法及對(duì)后期數(shù)據(jù)處理方式的改進(jìn)，熒光光譜技術(shù)得以不斷發(fā)展，很大程度上拓寬了熒光分析法的使用范圍，逐漸延伸至石油勘測、食品安全、環(huán)境保護(hù)和生命醫(yī)學(xué)等應(yīng)用領(lǐng)域［3-4］。對(duì)肝細(xì)胞的研究是攻克肝癌必不可少的環(huán)節(jié)，而熒光光譜技術(shù)由于其準(zhǔn)確性高，穩(wěn)定性強(qiáng)，且方便易測等優(yōu)勢，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，在多種癌癥細(xì)胞診斷領(lǐng)域獲得極大發(fā)展，已經(jīng)成為一種極具影響力的有效檢測方法［5-8］。

本文通過顯微熒光光譜成像實(shí)驗(yàn)獲取肝細(xì)胞的特異性熒光光譜特征及分析熒光強(qiáng)度變化趨勢。為了證明細(xì)胞的熒光飽和強(qiáng)度與細(xì)胞的直徑大小的關(guān)系，結(jié)合熒光顯微鏡實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，來估算肝細(xì)胞平均直徑，并分析肝細(xì)胞熒光飽和趨勢變化。本文將細(xì)胞形態(tài)學(xué)與光譜學(xué)有機(jī)的融合，能夠提高肝癌診斷的準(zhǔn)確性和有效性。同時(shí)，為實(shí)現(xiàn)肝癌早期篩查提供光譜學(xué)依據(jù)，以及為接下來研究肝癌細(xì)胞的對(duì)比實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)過程

1.1 樣品配置

肝細(xì)胞選用：HL-7702［L-02］人肝細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境選用37℃、5%CO2飽和濕度的無菌培養(yǎng)箱。培養(yǎng)體系選擇PMll640培養(yǎng)基、10%新生牛血清、1%雙抗。正常細(xì)胞培養(yǎng)相對(duì)困難，因其增殖少，生長慢，選擇傳代方式為1∶2傳代，傳代時(shí)間在36～48h，且細(xì)胞貼壁時(shí)間4～6h，過程中利用光學(xué)顯微鏡觀察生長狀態(tài)［9］。消化離心處理，獲得足夠數(shù)量的肝細(xì)胞后，加入PBS溶液，用細(xì)胞槍吹散搖勻，通過顯微計(jì)數(shù)，配置所需濃度的細(xì)胞懸浮液。計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)配置細(xì)胞濃度為1×106cells/ml、7.5×105cells/ml、5.0×105cells/ml、2.5×105cells/ml、1.25×105cells/ml肝細(xì)胞懸浮液，每種濃度3組，減小實(shí)驗(yàn)誤差及偶然性。配置3組5×104cells/ml肝細(xì)胞懸浮液，用于流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。16孔板×2，每個(gè)孔分別種2×104cells細(xì)胞，放入孵箱中培養(yǎng)12h，用于熒光顯微鏡實(shí)驗(yàn)。

1.2 熒光光譜實(shí)驗(yàn)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)原理

自體熒光是由細(xì)胞內(nèi)固有的熒光團(tuán)吸收特定波長的光而引起的熒光發(fā)射。由于基態(tài)具有不同的振動(dòng)能級(jí)，因而每種物質(zhì)可激發(fā)出多個(gè)波長的特征發(fā)射光譜，當(dāng)然，隨著細(xì)胞代謝及病變過程進(jìn)行中產(chǎn)生的不同物質(zhì)也可產(chǎn)生不同的特征熒光［10］。細(xì)胞內(nèi)光敏物質(zhì)受到激發(fā)后，產(chǎn)生不同譜線形狀或強(qiáng)度的熒光光譜，由此分析細(xì)胞的種類和細(xì)胞內(nèi)部代謝物質(zhì)多種基團(tuán)變化。正常細(xì)胞在發(fā)生病變的過程中，由于自身增殖方式和代謝水平都發(fā)生變化，細(xì)胞內(nèi)固有熒光團(tuán)產(chǎn)生差異，通過自體熒光光譜的特異性能夠有效分析細(xì)胞情況，這是細(xì)胞自體熒光光譜用于生命醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的理論基礎(chǔ)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)過程

在實(shí)驗(yàn)中，將配置好的細(xì)胞懸浮液放入離心管中，用細(xì)胞槍吹散，確保肝細(xì)胞在熒光激發(fā)過程中處于懸浮狀態(tài)，細(xì)胞槍取出懸浮液置入0.9ML比色皿中。使用FL6500熒光光譜儀測量細(xì)胞懸浮液，狹縫的光譜帶寬為10.0nm，激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530～900nm，激發(fā)波長間隔1nm，掃描速度600nm/min，平均時(shí)間0.1s。細(xì)胞懸浮液配置好后在30min之內(nèi)完成測量，共三次檢測確保結(jié)果可信。

1.3 流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

流式細(xì)胞儀主要由四部分組成，包括流動(dòng)室和液流系統(tǒng)；激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測系統(tǒng)；計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)。結(jié)合流式細(xì)胞儀對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行分析，獲得前向角散射光和側(cè)向角散射光雙參數(shù)散點(diǎn)圖，來觀察肝細(xì)胞。前向散射角與細(xì)胞的大小有關(guān)，確切的說與細(xì)胞直徑平方密切相關(guān)，選擇FSC作為閾值可以排除樣品碎片以及鞘液中小液滴的干擾。利用圖像輔助流式細(xì)胞儀，可以一次觀察大數(shù)量細(xì)胞情況，實(shí)驗(yàn)過程中選用了3組5×104cells/ml肝細(xì)胞懸浮液，用于流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，來觀察肝細(xì)胞直徑特點(diǎn)。

1.4 熒光顯微鏡實(shí)驗(yàn)

熒光探針的作用是與本身熒光較弱或者無熒光的物質(zhì)特異性復(fù)合，產(chǎn)生熒光光譜，因其具有體積小、成本低、無需預(yù)處理、不受外界電磁場影響等特性，成為當(dāng)前一個(gè)重要的研究熱點(diǎn)［10］。在熒光顯微實(shí)驗(yàn)中，加入了兩種探針，分別與細(xì)胞核及細(xì)胞膜結(jié)合，通過特定波長光源激發(fā)，拍攝細(xì)胞的熒光圖像［11］。實(shí)驗(yàn)前的預(yù)處理基本操作：將探針加載入孔板中，放入孵箱靜置半小時(shí)，等待探針和作用位點(diǎn)充分結(jié)合染色，洗去浮色，防止干擾增強(qiáng)拍攝效果。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 熒光光譜結(jié)果

肝細(xì)胞懸浮液在488nm波長的光激發(fā)下，獲得特異性熒光發(fā)射譜，如圖1所示，為3組50Wcells/ml細(xì)胞懸浮液的熒光光譜?？梢园l(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞在550～900nm之間，位于588nm和660nm處存在特異性熒光峰，588nm處為最大激發(fā)強(qiáng)度。3組結(jié)果近乎相同，造成差異的原因可能是細(xì)胞懸浮液配置不均勻造成，實(shí)驗(yàn)先后順序不同，細(xì)胞狀態(tài)有略微差異也會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果，但結(jié)果具備可靠性。為了研究肝細(xì)胞的飽和強(qiáng)度趨勢，檢測不同濃度的細(xì)胞懸浮液，如圖2所示，為不同濃度懸浮液的熒光光譜。在不同濃度下，兩個(gè)明顯峰值位置基本不變，分別在588nm和660nm處，最大熒光強(qiáng)度隨著濃度增加而增強(qiáng)，但是增長趨勢放慢。

圖1 細(xì)胞濃度50Wcells/ml熒光光譜

圖2 細(xì)胞多種濃度熒光光譜圖

2.2 流式細(xì)胞儀結(jié)果

圖3是利用流式細(xì)胞儀分析組5×104cells肝癌細(xì)的熒光信號(hào)結(jié)果，圖上每一個(gè)點(diǎn)均代表一個(gè)細(xì)胞，并設(shè)置門來進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示肝細(xì)胞直徑比較集中，絕大部分的細(xì)胞群落集中在設(shè)置門內(nèi)。

圖3 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果

2.3 熒光顯微鏡結(jié)果

選擇兩種探針，型號(hào)分別為，核探針DAPI，C001激發(fā)/發(fā)射波長：358nm/461nm，以及膜探針DID，C018，激發(fā)/發(fā)射波長：485nm/502nm。

如圖4所示，此為加入核探針后的肝細(xì)胞熒光圖像，利用核探針染色可以對(duì)粘連的細(xì)胞團(tuán)實(shí)現(xiàn)優(yōu)化計(jì)數(shù)［12］。圖5為加入膜探針后的肝細(xì)胞熒光圖像，通過熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，可以發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞呈現(xiàn)梭型，利用膜探針可以更好地觀察細(xì)胞的大小和形態(tài)。

圖4 細(xì)胞核熒光圖像

圖5 細(xì)胞膜熒光圖像

同等放大倍率下，選擇30個(gè)不同視野下拍攝肝細(xì)胞的熒光圖像，與標(biāo)準(zhǔn)長度對(duì)比，統(tǒng)計(jì)結(jié)果并計(jì)算肝細(xì)胞平均直徑。在同等的放大倍數(shù)下，隨機(jī)統(tǒng)計(jì)30個(gè)視野下的熒光圖片，可以計(jì)算出肝細(xì)胞的直徑大概在13.1μm左右。

2.4 熒光飽和強(qiáng)度分析

圖6中橫軸表示不同濃度梯度，縱軸表示不同濃度下的最大熒光強(qiáng)度，對(duì)折線圖進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的最大熒光強(qiáng)度會(huì)隨著細(xì)胞濃度增大而增強(qiáng)，但是逐漸會(huì)呈現(xiàn)熒光飽和狀態(tài)，單個(gè)細(xì)胞自激發(fā)熒光效率降低。肝細(xì)胞熒光飽和強(qiáng)度在未達(dá)到5×105cells/ml前接近線性增加，但隨著濃度增大熒光強(qiáng)度增速降低，明顯呈現(xiàn)出飽和趨勢。

圖6 熒光飽和趨勢分析

3 結(jié)論

肝細(xì)胞培育過程中發(fā)現(xiàn)，正常肝細(xì)胞極易發(fā)生污染，應(yīng)注意好滅菌工作。正常肝細(xì)胞的貼壁較慢，生長速度較癌細(xì)胞低，生長周期長，培育過程適宜1：2傳代。熒光光譜儀檢測結(jié)果顯示，在488nm光源激發(fā)下肝細(xì)胞懸浮液獲得特異性熒光發(fā)射光譜，肝細(xì)胞在550～900nm之間，位于588nm和660nm處存在特異性熒光峰，588nm處為最大激發(fā)強(qiáng)度。在不同濃度下，兩個(gè)明顯峰值位置基本不變，分別在588nm和660nm處，最大熒光強(qiáng)度隨著濃度增大而增強(qiáng)，但是增長趨勢放慢。

熒光顯微結(jié)果顯示在同等的放大倍數(shù)下，隨機(jī)統(tǒng)計(jì)30個(gè)視野下的熒光圖像，可以計(jì)算出肝細(xì)胞的直徑大概在13.1μm左右。流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明肝細(xì)胞直徑比較集中。對(duì)于肝細(xì)胞平均直徑，細(xì)胞熒光飽和強(qiáng)度在未達(dá)到5×105cells/ml前接近線性增加，但隨著濃度越大熒光強(qiáng)度增速降低，逐漸呈現(xiàn)出飽和趨勢明顯的結(jié)果。

進(jìn)一步工作將是對(duì)比肝癌細(xì)胞，檢測肝癌細(xì)胞的熒光光譜，并通過流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和熒光顯微實(shí)驗(yàn)來獲取肝癌細(xì)胞的直徑，觀察熒光飽和趨勢的變化。本文的工作不僅探索了肝細(xì)胞的熒光特性，還計(jì)算了肝細(xì)胞的平均直徑，分析了肝細(xì)胞熒光飽和強(qiáng)度變化趨勢，為肝癌的早期診斷和篩查提供了光譜學(xué)依據(jù)。