潘烽平 李彥 張明明 陳一鵬

鋅指蛋白545（ZNF545）是ZFP轉錄因子家族中的新成員之一，位于染色體19q13.1，該區(qū)域在腫瘤中頻發(fā)雜合性缺失[1]。ZNF545在腫瘤中的表達沉默受其啟動子區(qū)的甲基化調控，相關研究發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性結直腸癌[2]、胃癌[3-4]、肝癌[5-6]、乳腺癌[7]、多發(fā)性骨髓瘤[8]中均能檢測到ZNF545的啟動子區(qū)頻繁發(fā)生甲基化，但在正常組織中甲基化發(fā)生率極低。ZNF545可以通過抑制腫瘤細胞的增殖來誘導其凋亡，繼而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[1-2,7]。目前關于ZNF545在結直腸癌中的表達及其臨床意義的報道較少。筆者觀測了ZNF545在結直腸癌組織及配對癌旁正常組織中的蛋白表達，并分析了其與結直腸癌患者臨床特征及生存預后的關系，現(xiàn)將結果報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2017年3月至2018年2月在本院接受結直腸癌根治術的32例患者為研究對象，收集其結直腸癌組織及配對癌旁正常組織標本（均經術后病理檢查證實）；所有患者術前未接受過放化療，組織標本的使用取得患者或家屬的知情同意，本研究經醫(yī)院倫理委員會審查通過。另購買1份組織芯片（包含136例結直腸癌組織及配對癌旁正常組織，上海芯超生物有限公司）。1.2 總RNA的抽提、反轉錄和qRT-PCR 按照Trizol試劑盒說明書抽提32例結直腸癌組織及癌旁正常組織的總RNA。采用Invitrogen公司的Reverse Transcription System試劑盒反轉錄合成cDNA。使用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進行qRT-PCR。按以下條件上機反應：95℃預變性10min；95℃變性 10s，退火 60℃1min，共45個循環(huán)。以GAPDH為參照，計算ZNF545在結直腸癌組織及癌旁正常組織中的mRNA相對表達量。

1.3 免疫組化 組織芯片用ZNF545抗體（Abcam，1∶200，ab228946）于4℃孵育過夜；用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗于室溫孵育30min。由2位病理科醫(yī)生根據(jù)染色強度和陽性細胞比例進行獨立評分。染色強度的評分標準：無染色為0分，弱染色為1分，中度染色為2分，強染色為3分；陽性細胞比例的評分標準：0%為0分，＞0%～5%為 1分，＞5%～30%為2分，＞30%～60%為3分，＞60%為4分。染色強度與陽性細胞比例的評分之和為免疫組化評分，＞3分為高表達，≤3為低表達。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，組間比較采用配對樣本t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，計算ZNF545蛋白高、低表達患者的5年生存率，并采用log-rank法比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 結直腸癌組織與癌旁正常組織中ZNF545 mRNA相對表達量比較 32例結直腸癌組織中ZNF545 mRNA相對表達量為0.43±0.16，明顯低于癌旁正常組織的 1.02±0.35，差異有統(tǒng)計學意義（t=-9.19，P＜0.05），見圖1。

2.2 結直腸癌組織與癌旁正常組織中ZNF545蛋白表達比較 對組織芯片進行免疫組化染色，可見ZNF545蛋白主要存在于正常結直腸黏膜細胞質和細胞核中，呈彌漫性棕黃色，見圖2（插頁）。結直腸癌組織中ZNF545蛋白低表達率為65.4%（89/136），高于配對癌旁正常組織的 25.7%（35/136），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=43.2，P＜0.05）。

圖1 結直腸癌組織與癌旁正常組織中ZNF545 mRNA相對表達量比較（與癌旁正常組織比較，*P＜0.05）

圖2 組織芯片結直腸癌組織與配對癌旁正常組織中ZNF545蛋白表達情況（免疫組化染色；a-b：×5；c-d：×40）

2.3 結直腸癌組織中ZNF545蛋白表達與患者臨床特征的關系 ZNF545蛋白低表達與患者腫瘤直徑、浸潤深度、TNM分期相關（均P＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤位置、分化程度、淋巴結轉移無關（均P＞0.05），見表1。

表1 ZNF545蛋白表達與患者臨床特征的關系[例（%）]

2.4 ZNF545蛋白表達與結直腸癌患者生存預后的關系 ZNF545蛋白低表達患者的5年生存率為53.6%，明顯低于ZNF545蛋白高表達者的76.5%，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.75，P＜0.05），見圖 3。

圖3 ZNF545蛋白高、低表達結直腸癌患者生存曲線

3 討論

結直腸癌是全球范圍內高發(fā)病率、高病死率的惡性腫瘤之一[9]。在我國惡性腫瘤中，結直腸癌發(fā)病率居第3位，病死率居第4位[10]?，F(xiàn)有的生物標志物仍不能有效地預測早期結直腸癌，中晚期結直腸癌患者的5年生存率不容樂觀[11]。早期發(fā)現(xiàn)，結直腸癌是提高患者生存的關鍵。因此，進一步深入探討結直腸癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制，將有助于尋找到特異度、靈敏度更高的生物標志物，以提高早期結直腸癌的診斷率。

ZFP是真核生物中最大的轉錄因子家族，廣泛參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。其中約三分之一在其保守結構域上含有 Krüppel-associated box（KRAB），稱為 KRAB-ZFP，是ZNF家族中最經典的一類[12]。正是由于KRAB-ZFP這種特殊的結構特點，即KRAB結構域能與其協(xié)同蛋白的氨基端相結合，而C2H2-鋅指結構可與基因啟動子區(qū)相結合，使其在細胞增殖、分化、凋亡、正常細胞向惡性細胞轉化等過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用[13]。ZNF545是KRAB-ZFP家族的新成員之一，位于染色體19q13.1，該區(qū)域在多種腫瘤中頻發(fā)雜合性缺失。已有研究報道，在胃癌、肝癌及乳腺癌等實體腫瘤中，ZNF545基因啟動子區(qū)CpG島頻發(fā)甲基化，使其在癌組織中呈低表達或缺失表達。ZNF545可以通過抑制腫瘤細胞的增殖來誘導其凋亡，繼而抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。在結直腸癌中，ZNF545同樣存在甲基化，并在結直腸癌細胞中發(fā)揮著抑癌基因的生物學作用[2]。

為研究ZNF545在結直腸癌組織及其癌旁正常組織中的表達情況，筆者首先收集并檢測了32例結直腸癌組織及其癌旁正常組織標本ZNF545 mRNA表達情況，結果顯示結直腸癌組織中ZNF545 mRNA相對表達量低于癌旁正常組織。為進一步驗證ZNF545蛋白在結直腸癌組織中是否呈異常低表達，筆者購買了結直腸癌組織芯片并進行免疫組化檢測，結果發(fā)現(xiàn)在結直腸癌組織及其配對癌旁正常組織中，ZNF545蛋白均主要定位于細胞核及細胞質中；與癌旁正常組織比較，結直腸癌組織中ZNF545蛋白呈低表達，差異有統(tǒng)計學意義；進一步分析ZNF545蛋白表達與患者臨床資料的關系，結果發(fā)現(xiàn)結直腸癌組織中ZNF545蛋白低表達率與腫瘤直徑、浸潤深度、TNM分期有關，與患者性別、年齡、腫瘤位置、淋巴結轉移無關。此外，結直腸癌患者ZNF545蛋白低表達者5年生存率較高表達者明顯下降?？梢姡琙NF545在結直腸癌組織中呈異常低表達，與結直腸癌患者的不良預后有關。

綜上所述，ZNF545在結直腸癌組織中呈低表達，與患者腫瘤直徑、浸潤深度、TNM分期及生存預后有關。關于ZNF545在結直腸癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮的調控作用及其分子機制，有待進一步深入研究。