張偉杰，薛 磊，馬志俊，李冬薈，王留興

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南 鄭州450052)

近年來乳腺癌的發(fā)病率在世界各國均處于上升趨勢，預(yù)計2020年美國女性乳腺癌患者將有276 480例，占女性新發(fā)惡性腫瘤的30%，居女性惡性腫瘤發(fā)病率首位，死亡42 170例(12%)，居女性惡性腫瘤死亡率第2位[1]。2019年國家癌癥中心最新數(shù)據(jù)顯示我國2015年乳腺癌居女性惡性腫瘤發(fā)病率第1位(占比17.10%)，死亡率居第5位(占比8.16%)[2]。三陰性乳腺癌例數(shù)約占乳腺癌總例數(shù)的10%～20%，三陰性乳腺癌多呈浸潤性生長，惡性程度偏高，易復(fù)發(fā)和多器官轉(zhuǎn)移，預(yù)后較其他分子分型差，三陰性乳腺癌除了化療外無有效治療手段，目前國內(nèi)外對三陰性乳腺癌的治療手段無突破性研究進(jìn)展。腫瘤組織中其實只有很小一部分細(xì)胞具有引起腫瘤發(fā)生、維持腫瘤生長、保持腫瘤異質(zhì)性的能力，被稱為腫瘤干細(xì)胞，其與腫瘤起源、復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移、耐藥密切相關(guān)，乳腺癌亦是如此[3]。

為了尋找乳腺癌干細(xì)胞潛在的治療靶點，前期研究中我們利用流式細(xì)胞儀分選出CD44+CD24-/low乳腺癌干細(xì)胞，基因芯片和測序分析乳腺癌干細(xì)胞和普通乳腺癌細(xì)胞兩者差異表達(dá)的基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與普通乳腺癌細(xì)胞相比，四次跨膜L6家族成員1(transmembrane 4 L6 family member 1，TM4SF1)在乳腺癌干細(xì)胞中顯著高表達(dá)。本課題組前期研究[4]同時發(fā)現(xiàn)TM4SF1在乳腺癌組織中比癌旁組織及正常乳腺組織明顯高表達(dá)，并且分化程度越低、分期越晚，TM4SF1表達(dá)水平越高；其中三陰性乳腺癌組織TM4SF1蛋白陽性表達(dá)率最高。這些結(jié)果都提示TM4SF1參與了三陰性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移。

本研究旨在探討TM4SF1在三陰性乳腺癌干細(xì)胞中的作用以及通過靶向TM4SF1抑制其自我更新的可能性，分析該通路作為三陰性乳腺癌干細(xì)胞新的治療靶點的可行性，為下一步研究提供新的理論和思路，對三陰性乳腺癌具有潛在的治療價值。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院，保存于我院腫瘤中心實驗室。

1.2 主要試劑cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒，日本TaKaRa公司；One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit，日本TaKaRa公司；Taqman?Micro RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國Life Technologies公司；Taq Man?Univsersal PCR Master Mix Ⅱ，美國Life Technologies公司；SYBRPremix Ex Taq Ⅱ，日本TaKaRa公司；BCA法蛋白定量試劑盒，北京普利萊基因科技有限公司；TM4SF1抗體(兔)，美國Abcam公司；β-actin抗體(鼠)，美國Sigma公司；鼠二抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔二抗，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Western blotting試劑盒，北京普利萊北京普利萊基因科技有限公司；CCK-8試劑盒，日本Tongren公司DNA純化試劑盒，日本TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒，日本TaKaRa公司；Phusion超保真DNA聚合酶試劑盒，美國NEB公司；3TM4SF1質(zhì)粒(CH891913)，美國Vigene公司。

1.3 主要儀器普通和倒置顯微鏡，日本Olympus公司；ABI7500 PCR儀，美國Applied Biosystems公司；Light Cycler480 PCR儀，瑞士METTLER TOLEDO公司；DYY-Ⅲ6B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀,北京六一儀器廠；GDS-8000凝膠圖像分析系統(tǒng)，美國UVP公司；微型垂直電泳及電轉(zhuǎn)系統(tǒng)，美國BIO-RAD公司；流式細(xì)胞儀，美國BD公司。

1.4 主要引物TM4SF1引物:前,5’-CAGCCCTTGGCTTAGCAGA-3’；后： 5’-CCACAATGCTTGGGTTCA-3’。GAPDH引物: 前, 5’-GAGTCAACGG ATTTGGTCGT-3’；后：5’-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。3種siRNA序列：TM4SF1-homo-497 5’-GCGAUGCUUUCUUCUGUAUTT-3’(DsiRNA-1)；TM4SF1-homo-733 5’-GGCUCUUGGUGGAAUUGAATT-3’(DsiRNA-2)；TM4SF1-homo-813 5’-GCUCUCACCAACAGCAAUATT-3’(DsiRNA-3)。

1.5 實驗動物20只3周齡、體質(zhì)量約15 g的SPF級BALB/C雌性裸鼠，購自北京維通利華公司，飼養(yǎng)于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物研究所，所用實驗器具材料均消毒滅菌后使用，進(jìn)入實驗室時需穿無菌服和戴口罩。

1.6 siRNA轉(zhuǎn)染使用Lipofectamine2000在三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染siRNA。具體步驟：1)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成的2.5 nmol雙鏈siRNA1、siRNA2和siRNA3中分別加入125 μL DEPC水，配制20 μmol·L-1的母液，置于4 ℃保存?zhèn)溆茫?)轉(zhuǎn)染相關(guān)耗材經(jīng)DEPC水處理去除RNA酶，部分使用無RNA酶相關(guān)耗材；3)轉(zhuǎn)染前1 d將消化后的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞接種到六孔板，過夜使細(xì)胞融合度達(dá)到50%～60%后用于轉(zhuǎn)染實驗；4)取5 μL Lipofectamine2000加入250 μL RPMI-1640培養(yǎng)基中充分混勻(a液)，同時，將3種siRNA分別加入另外250 μL RPMI-1640培養(yǎng)基中充分混勻，室溫靜置5 min(b液)。a液和b液溫和混勻后，室溫靜置15～20 min；5)細(xì)胞先用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗2遍，與1 mL不含血清、抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基混勻后加入培養(yǎng)皿中；6)轉(zhuǎn)染6 h后，改為正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h完成轉(zhuǎn)染；7)Western blot法驗證轉(zhuǎn)染效果。

1.7 Western blot法檢測蛋白表達(dá)具體步驟：細(xì)胞總蛋白的提??；BCA法測定實驗各組細(xì)胞的蛋白量；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜；檢測目的蛋白。

1.8 流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞1)將處于對數(shù)生長期的三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞消化、計數(shù)、離心；2)用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)到1×106個/mL，取1 mL，加入2 μL利血平，于培養(yǎng)箱中孵育；3)30 min后，分別向加和不加利血平的每mL細(xì)胞懸液中加入Hoechst33342 2 μL，再孵育90 min；4)收集并用預(yù)冷PBS沖洗細(xì)胞2次，少量預(yù)冷PBS再次重懸細(xì)胞沉淀；5)分選細(xì)胞。

1.9 CCK-8法測定細(xì)胞生長曲線1)將處于對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染后pENTER、pENTER-TM4SF1、NC-siRNA DsiRNA-1、DsiRNA-2、DsiRNA-3和同樣作為對照的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞消化計數(shù)后，每孔500個細(xì)胞接種到96孔板中過夜；2)細(xì)胞生長的第1、3、5、7天，每孔加入10 μL CCK8，然后檢測450 nm處光密度(OD)值；3)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.10 平板克隆形成實驗1)消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞，每組各取500個接種于3個直徑3.5 cm的培養(yǎng)皿中；2)培養(yǎng)2周，可見明顯細(xì)胞集落時終止培養(yǎng)；3)棄去培養(yǎng)基，PBS洗2次，加入甲醇固定10 min后棄去甲醇，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%結(jié)晶紫染色20 min；4)清水沖洗培養(yǎng)皿，去除非細(xì)胞集落上的結(jié)晶紫;5)顯微鏡下記數(shù)大于50個細(xì)胞的集落數(shù)。

1.11 動物實驗1)20只3周齡、體質(zhì)量約15 g的SPF級BALB/C雌性裸鼠于實驗前1 d稱重，然后按體質(zhì)量分組，每組5只；2)處于對數(shù)生長期細(xì)胞經(jīng)消化、離心、PBS清洗重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×106個/mL。小注射器抽吸0.1 mL接種于裸鼠雙側(cè)腋部皮下；3)5周后測量瘤體長短徑，處死裸鼠，將腫瘤完整剝離，拍照，稱重。

2 結(jié)果

2.1 三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系的乳腺癌干細(xì)胞和普通乳腺癌細(xì)胞中TM4SF1 mRNA和蛋白水平比較在三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系中，TM4SF1 mRNA在乳腺癌干細(xì)胞中的相對表達(dá)量是普通乳腺癌細(xì)胞的3倍(P<0.05)。在三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系中，TM4SF1蛋白在乳腺癌干細(xì)胞中表達(dá)較高，在普通乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)較低，兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，這與我們前期芯片和PCR的結(jié)果均一致。這提示TM4SF1可能在乳腺癌干細(xì)胞中發(fā)揮作用。見圖1。

圖1 三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系的乳腺癌干細(xì)胞和普通乳腺癌細(xì)胞中TM4SF1 mRNA(A)和蛋白(B)表達(dá)

2.2 各組三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系中TM4SF1蛋白表達(dá)比較Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與空白對照組和NC-siRNA組比較，DsiRNA-1組、DsiRNA-2組、DsiRNA-3組的TM4SF1蛋白表達(dá)降低，以DsiRNA-1組降低最為明顯(P均<0.05)。見圖2。

2.3 各組三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系中乳腺癌干細(xì)胞比例比較空白對照組、NC-siRNA組、DsiRNA-1組、DsiRNA-2組、DsiRNA-3組乳腺癌干細(xì)胞比例分別為0.96%、0.95%、0.2%、0.23%、0.25%。與空白對照組和NC-siRNA組比較，DsiRNA-1組、DsiRNA-2組、DsiRNA-3組的乳腺癌干細(xì)胞比例降低，以DsiRNA-1組降低最為明顯(P均<0.05)。

圖2 各組三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系中TM4SF1蛋白表達(dá)比較

A：空白對照組；B：NC-siRNA組；C：DsiRNA-1組；D：DsiRNA-2組；E:DsiRNA-3組

2.4 各組三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系的細(xì)胞增殖速度比較各組三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系的細(xì)胞增殖增殖速度相近(P均>0.05)。這提示TM4SF1可能是作用于乳腺癌干細(xì)胞。見圖3。

圖3 各組三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系的細(xì)胞增殖速度比較

2.5 各組三陰性乳腺癌干細(xì)胞的平板克隆形成能力比較從上述各組細(xì)胞分選出乳腺癌干細(xì)胞進(jìn)行平板克隆形成實驗，其中親本MDA-MB-231細(xì)胞形成的克隆數(shù)明顯多于沉默TM4SF1表達(dá)的DsiRNA-1組、DsiRNA-2組、DsiRNA-3組所形成的克隆數(shù)(P均<0.05)。這提示TM4SF1能夠增強三陰性乳腺癌干細(xì)胞的克隆形成能力，即對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系的單個乳腺癌干細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。見圖4。

2.6 各組裸鼠瘤體體積比較裸鼠成瘤實驗結(jié)果顯示，接種5周后三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系組瘤體體積為(3.20±0.08)mm3，明顯大于三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系DsiRNA-1組的(0.81±0.07)mm3，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 各組三陰性乳腺癌干細(xì)胞的平板克隆形成能力比較

A:空白對照組；B: NC-siRNA組; C: DsiRNA-1組; D: DsiRNA-2組; E: DsiRNA-3組

3 討論

TM4SF1基因位于人3q21-3q25，編碼一種低相對分子質(zhì)量糖蛋白[5]。TM4SF1在許多上皮來源的惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，包括肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、前列腺癌、膀胱癌等[6-11]。有報道認(rèn)為，TM4SF1參與血管內(nèi)皮細(xì)胞偽足形成，進(jìn)而促進(jìn)血管的生成[12]。TM4SF1可能參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞生長、活化和浸潤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程[13]。研究[6]證實，抗TM4SF1單克隆抗體處理肺癌細(xì)胞后，其侵襲能力顯著降低。前列腺癌細(xì)胞的TM4SF1基因敲除后，細(xì)胞的遷移能力明顯降低[10]。TM4SF1可能還參與腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化這一生物學(xué)過程[14]。TM4SF1可能對多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展等生物學(xué)過程有影響，但其具體作用機制尚不明確。

間充質(zhì)干細(xì)胞中TM4SF1高表達(dá)，但其他血液細(xì)胞、組織細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中未見其表達(dá)，這提示TM4SF1可以作為干細(xì)胞表面標(biāo)志物[15]。有研究[16]證實，TM4SF1可能參與腫瘤的多器官轉(zhuǎn)移再激活，但對細(xì)胞增殖無明顯影響。

本研究首先通過分析不同乳腺癌細(xì)胞中TM4SF1蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，其在乳腺癌干細(xì)胞中高表達(dá)。為了進(jìn)一步研究TM4SF1基因在乳腺癌干細(xì)胞中的具體作用，本研究設(shè)計了針對TM4SF1基因3個不同靶點的3條siRNA干擾序列用于沉默TM4SF1基因的表達(dá)，轉(zhuǎn)染后三者均能有效沉默TM4SF1基因表達(dá)，導(dǎo)致乳腺癌干細(xì)胞比例降低，但細(xì)胞增殖速度無明顯差異；形成的克隆數(shù)明顯降低。體外實驗結(jié)果表明，接種5周后三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系組瘤體體積明顯大于三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系DsiRNA-1組，提示乳腺癌干細(xì)胞能增強裸鼠致瘤能力，這也是關(guān)于細(xì)胞自我更新能力變化的最好證明。

綜上所述，通過靶向TM4SF1通路能夠抑制三陰性乳腺癌干細(xì)胞自我更新，該通路有可能作為乳腺癌干細(xì)胞新的治療靶點，對三陰性乳腺癌具有潛在的治療價值。但是TM4SF1影響干細(xì)胞的具體作用機制還有待進(jìn)一步研究。