聶進(jìn) 唐書福 張建勇 趙建軍

【摘要】 目的：觀察外源性降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的急性肺損傷（ALI）大鼠肺泡灌洗液（BALF）腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）表達(dá)的影響。方法：42只SD雄性大鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組（NS組）、CGRP對(duì)照組（CGRP組）、急性肺損傷組（ALI組，14只）和CGRP干預(yù)組（CGRP干預(yù)組，14只）四組，其中ALI組分為6 h ALI組和12 h ALI組兩亞組，干預(yù)組分為CGRP+6 h ALI組和CGRP+12 h ALI組兩亞組，每亞組7只。ALI組按LPS 10 mg/kg于尾靜脈注射后6 h和12 h后取材;干預(yù)組予CGRP（5 μg/kg）尾靜脈注射后1 h，再予LPS （10 mg/kg）尾靜脈注射后分別于第6小時(shí)和第12小時(shí)后取材;CGRP對(duì)照組予CGRP（5 μg/kg）尾靜脈注后6 h取材;NS組予生理鹽水（1 ml/kg）靜脈注射后6 h取材。記錄并比較各組SD大鼠BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)和濕/干重比值（W/D）;HE染色觀察各組肺組織病理變化情況;ELISA法檢測(cè)各組大鼠BALF TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平。結(jié)果：ALI組大鼠BALF細(xì)胞總數(shù)和分類計(jì)數(shù)、W/D比值、TNF-α、IL-1β的表達(dá)量均高于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;同時(shí)間點(diǎn)損傷組與干預(yù)組比較，BALF細(xì)胞分類計(jì)數(shù)、TNF-α、IL-1β的表達(dá)均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。NS組與CGRP對(duì)照組大鼠BALF細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)、TNF-α和IL-1β的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：外源性CGRP可降低大鼠BALF中TNF-α、IL-1β的含量，對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI大鼠具有抗炎作用。

【關(guān)鍵詞】 急性肺損傷 腫瘤壞死因子-α 白細(xì)胞介素-1β 炎癥反應(yīng)

[Abstract] Objective： To observe the intervention effect of calcitonin gene-related peptide （CGRP） on the expression of TNF-α and IL-1β in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） of lipopolysaccharide （LPS） induced acute lung injury （ALI） rats. Method： Forty-two SD rats were randomly divided into 6 groups according to a random number method， 7 rats in each group. The 6 groups were listed as normal saline control group （NS group）， CGRP control group （CGRP group）， 6-hour acute lung injury group （6 h ALI group）， 12-hour acute lung injury group （12 h ALI group）， CGRP intervention 6-hour group （CGRP+6 h ALI group）， and CGRP 12-hour group （CGRP+12 h ALI group）. 6 h ALI group and 12 h ALI group were treated with LPS （10 mg/kg） via tail vein and specimen obtained at 6 hours and 12 hours respectively. CGRP+6 h ALI group and CGRP+12 h ALI group were injected with CGRP （5 μg/kg） by tail vein and injected with LPS （10 mg/kg） after 1 h of CGRP injection， specimen obtained at 6 hours and 12 hours respectively. After the tail vein injection of CGRP （5 μg/kg）， the specimen of CGRP group was obtained 6 hours later; after the tail vein was injected with （1 ml/kg） of normal saline， the specimen of NS group was obtained 6 hours later. After that， BALF cell counts and differential counts were performed in each group ; right upper lung tissues were used to determine the wet/dry weight ratio （W/D）; pathological changes of lung tissues in each group were observed by HE staining; ELISA was used to measure the levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-1β （IL-1β） in BALF of each group. Result： The ALI group compared with NS group ， BALF cell counts and differential counts， the wet/dry weight ratio （W/D）， the expression of TNF-α and IL-1β were increased， the differences were statistically significant （P<0.05）. The ALI group compared with CGRP intervention group at the same time， BALF cell differential counts， and the expression of TNF-α and IL-1β were increased， the differences were statistically significant （P<0.05）. There were no significantly differences in BALF cell counts and differential counts， the expression of TNF-α and IL-1β between NS group and CGRP group （P>0.05）. Conclusion： CGRP possesses potential protection against LPS-induced acute lung injury through its anti-inflammatory property.

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）或急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是由各種肺內(nèi)和肺外致病因素導(dǎo)致的急性彌漫性肺損傷和進(jìn)而發(fā)展的急性呼吸衰竭，是臨床常見的急危重癥之一[1]。ALI/ARDS起病急、發(fā)展迅速，缺乏特異性和有效的治療手段，病死率高達(dá)40%以上[2]。目前研究表明，炎癥反應(yīng)是ALI/ARDS發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機(jī)制。降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）是一種新型的抗炎介質(zhì)，文獻(xiàn)[3]報(bào)道CGRP可減輕ALI/ARDS的炎癥反應(yīng)。本研究擬予尾靜脈注射LPS的方式構(gòu)建ALI大鼠模型，予外源性CGRP進(jìn)行干預(yù)，通過檢測(cè)各組ALI大鼠BALF 細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)、TNF-α和IL-1β表達(dá)水平，探討CGRP是否抑制TNF-α、IL-1β的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對(duì)ALI/ARDS的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠42只，6～8周齡，體重180～220 g，重慶第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[合格證編號(hào)為SCXK（渝）2012-0005]提供，在標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼養(yǎng)間給予無菌食物和水飼養(yǎng)。將42只大鼠隨機(jī)分為生理鹽水對(duì)照組（NS組，7只）、CGRP對(duì)照組（CGRP組，7只）、急性肺損傷組（ALI組，14只）和干預(yù)組（CGRP干預(yù)組，14只），其中急性肺損傷組分為6 h ALI組和12 h ALI組兩亞組，干預(yù)組分為CGRP+6 h ALI組和CGRP+12 h ALI組兩亞組，每亞組7只。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及藥物 脂多糖（LPS）購于美國Sigma公司，降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）購于Tocris公司，ELISA試劑盒購于購于美國R&D公司。

1.2 動(dòng)物模型的建立

ALI組按LPS 10 mg/kg于尾靜脈注射，6 h和12 h后取材;干預(yù)組予CGRP（5 μg/kg）尾靜脈注射，CGRP注射成功后1 h按LPS（10 mg/kg）尾靜脈注射，分別于6 h和12 h后取材;CGRP組尾靜脈注CGRP（5 μg/kg）6 h后取材;NS組尾靜脈注射生理鹽水1 ml/kg，6 h后取材。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1 BALF中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù) 取各組SD大鼠BALF 10 μl滴于細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，光鏡下按計(jì)數(shù)板上的細(xì)胞數(shù)目。將BALF離心后取20 μl沉淀涂片（每個(gè)標(biāo)本涂2～3張），待涂片晾干后進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色，采取單盲法在油鏡下計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)各組中性粒細(xì)胞所占的百分比。

1.3.2 肺組織濕/干重比值（W/D） 用濾紙吸干右肺上葉肺組織表面血液及水分，電子天平稱量記為濕重（W），置于80 ℃恒溫箱烤48 h后稱量記為干重（D），計(jì)算濕/干重比（W/D），W/D值反映肺水腫的嚴(yán)重程度。

1.3.3 肺組織病理改變 肺組織經(jīng)石蠟包埋后 ，切4 μm切片，常規(guī)HE染色，觀察肺組織病理變化。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)BALF中TNF-α、IL-β含量 灌洗左肺收集BALF，4 ℃下3 000 r/min離心5 min，取上清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。ELISA法檢測(cè)BALF上清液中TNF-α、IL-β的含量，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)通過SPSS 17.0軟件分析系統(tǒng)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示。多樣本均數(shù)比較時(shí)采用單因素方差分析，方差齊者使用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者使用Dunnetts T3檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)校正標(biāo)準(zhǔn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BALF細(xì)胞計(jì)數(shù)及分類計(jì)數(shù)

與NS組比較，6 h ALI組、CGRP+6 h ALI組、12 h ALI組和CGRP+12 h ALI組大鼠BALF中性粒細(xì)胞百分比多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與6 h ALI組比較，CGRP+6 h ALI組、12 h ALI組BALF中性粒細(xì)胞百分比低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與12 h ALI組比較，CGRP+12 h ALI組大鼠BALF中性粒細(xì)胞百分比低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;CGRP+12 h ALI組大鼠BALF中性粒細(xì)胞百分比與CGRP+6 h ALI組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.2 肺組織濕/干重（W/D）比值測(cè)定

與NS組比較，6 h ALI組、CGRP+6 h ALI組、12 h ALI組和CGRP+12 h ALI組大鼠肺組織W/D比值大，以12 h ALI組較為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與6 h ALI組比較，CGRP+6 h ALI組肺組織W/D比值小，12 h ALI組肺組織W/D比值大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與12 h ALI組相比較，CGRP+12h ALI組肺組織W/D比值減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;CGRP+12 h ALI組肺組織W/D比值與CGRP+6 h ALI組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表2。

2.3 各組肺組織HE染色病理改變

參照J(rèn)in等[4]文獻(xiàn)中的方法進(jìn)行肺損傷病理學(xué)評(píng)價(jià)。NS組大鼠肺組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)正常，組織完整，氣管壁及肺泡壁結(jié)構(gòu)清晰，黏膜完整，管腔通暢，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤;6 h ALI組和12 h ALI組大鼠肺組織病理提示氣管及血管周圍呈現(xiàn)以中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)中炎癥細(xì)胞浸潤明顯，黏膜充血水腫，小葉間隔增寬、增厚;CGRP+6 h ALI組和CGRP+12 h ALI組大鼠肺組織病理提示氣管及血管周圍出現(xiàn)以嗜中性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤;黏膜充血水腫，氣道上皮細(xì)胞及杯狀細(xì)胞腫脹，小葉間隔增寬、增厚，但較相應(yīng)的ALI組減輕，見圖1。

2.4 ELISA法檢測(cè)大鼠BALF中TNF-α含量

與NS組比較，6 h ALI組、CGRP+6 h ALI組、12 h ALI組和CGRP+12 h ALI組大鼠BALF TNF-α含量多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與6 h ALI組比較，CGRP+6 h ALI組大鼠BALF TNF-α含量少，12 h ALI組大鼠BALF TNF-α含量多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與12 h ALI組相比較，CGRP+12 h ALI組大鼠BALF TNF-α含量少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與CGRP+6 h ALI組比較，CGRP+12 h ALI組大鼠BALF TNF-α含量多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

2.5 ELISA法檢測(cè)大鼠BALF中IL-1β含量

與NS組比較，6 h ALI組、CGRP+6 h ALI組、12 h ALI組和CGRP+12 h ALI組大鼠BALF IL-1β含量多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與6 h ALI組比較，CGRP+6 h ALI組IL-1β含量少，12 h ALI組大鼠BALF IL-1β含量多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與12 h ALI組比較，CGRP+12 h ALI組大鼠BALF IL-1β含量少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與CGRP+6 h ALI組比較，CGRP+12 h ALI組大鼠BALF IL-1β含量多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4。

3 討論

ALI/ARDS是由創(chuàng)傷、嚴(yán)重感染、中毒等多種因素導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征的肺部表現(xiàn)，主要病理特征是炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的肺微血管內(nèi)皮及肺泡上皮受損，微血管通透性增高，肺泡腔滲出富含蛋白的液體，進(jìn)而引起肺水腫及透明膜形成，臨床表現(xiàn)為呼吸窘迫、難治性低氧血癥和呼吸衰竭，肺部影像學(xué)表現(xiàn)為雙肺彌漫性滲出性改變[5]，是目前呼吸系統(tǒng)急危重癥疾病研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)之一，但ALI/ARDS發(fā)病機(jī)制尚未安全闡明并且預(yù)后不良。

近年來，隨著對(duì)ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制不斷深入研究，發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)參與的炎癥反應(yīng)在ALI/ARDS的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。炎癥細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，最重要的是TNF-α、IL-1β，導(dǎo)致大量中性粒細(xì)胞肺內(nèi)聚集、激活，并通過“呼吸暴發(fā)”釋放氧自由基、蛋白酶和炎癥介質(zhì)，引起靶細(xì)胞損害，表現(xiàn)為肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞損傷，肺微血管通透性增高和微血栓形成，最終導(dǎo)致肺部彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，從而引起呼吸窘迫、頑固性低氧血癥[5]。研究表明，膿毒癥是ALI/ARDS常見原因之一，膿毒癥伴發(fā)的全身嚴(yán)重炎癥反應(yīng)是急性肺損傷的主要發(fā)病機(jī)制[6-7]，革蘭陰性桿菌感染是膿毒癥最常見的病因[8]，而脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性桿菌細(xì)胞壁的主要組分之一，對(duì)膿毒癥的發(fā)生和發(fā)展發(fā)揮著重要的作用[9]。ALI的主要病理改變包括肺組織中炎性細(xì)胞浸潤，肺間質(zhì)和肺泡出血和水腫，肺泡毛細(xì)血管屏障受損，通透性增加[10]。本研究采用10 mg/kg LPS尾靜脈注射制備大鼠ALI模型，結(jié)果顯示，ALI組大鼠各時(shí)相BALF中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、W/D比值均高于NS組，并且肺組織病理切片見毛細(xì)血管明顯充血，肺泡及間質(zhì)見大量中性粒細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)可見紅細(xì)胞滲出，肺泡隔增寬、紊亂，提示尾靜脈注射LPS已成功建立大鼠ALI模型。

研究表明，在炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過程中TNF-α是始動(dòng)因素，IL-1β發(fā)揮協(xié)同作用[11]。IL-1β不能直接活化白細(xì)胞，但可以引起IL-8的分泌，通過改變前炎癥介質(zhì)或抗炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)和影響組織多型核中性粒細(xì)胞聚集而促進(jìn)炎癥的發(fā)展[12]?？梢奣NF-α、IL-1β炎癥介質(zhì)在ALI發(fā)病中起著重要的作用。本研究結(jié)果顯示，ALI組大鼠各時(shí)相BALF釋放的炎癥因子TNF-α、IL-β明顯高于NS組（P<0.05），提示TNF-α和IL-1β被激活，參與炎癥的級(jí)聯(lián)式放大反應(yīng)，促進(jìn)ALI的發(fā)生與發(fā)展。

CGRP是由37個(gè)氨基酸組成的小分子多肽，由降鈣素基因選擇性剪切編碼后合成，參與機(jī)體多種生理和病理過程[13]。奎莉越等[14]研究顯示，CGRP干預(yù)可抑制脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的大鼠肺上皮細(xì)胞炎癥因子的分泌。CGRP不僅有擴(kuò)張血管、減輕肺水腫，還有抗炎的作用。本研究結(jié)果顯示，CGRP干預(yù)組大鼠W/D的比值、BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比、TNF-α、IL-β均低于相同時(shí)間點(diǎn)ALI組大鼠，提示外源性CGRP可抑制LPS誘導(dǎo)的ALI大鼠肺組織的炎癥反應(yīng)及肺水腫，對(duì)ALI具有保護(hù)作用。

綜上所述，炎癥反應(yīng)是ALI/ARDS的主要發(fā)病機(jī)制之一，炎癥介質(zhì)TNF-α和IL-1β的激活，參與炎癥的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，促進(jìn)ALI/ARDS的發(fā)生與發(fā)展。本研究說明CGRP作為新型的抗炎介質(zhì)，通過降低炎癥介質(zhì)（TNF-α、IL-1β等）的釋放，減輕了肺臟的損傷，減輕了肺水腫，從而發(fā)揮對(duì)大鼠LPS相關(guān)ALI的保護(hù)作用。

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（收稿日期：2019-07-22） （本文編輯：何玉勤）