王麗玲，柏明娥，劉本同，王衍彬，徐高福

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青錢柳葉提取物對Caco-2細(xì)胞二糖酶活性的抑制作用

王麗玲1，柏明娥1，劉本同1，王衍彬1，徐高福2

（1. 浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；2. 浙江省淳安縣新安江開發(fā)總公司，浙江 淳安 311700）

采用Caco-2細(xì)胞模型，分析了青錢柳葉水提物、醇提后的水提物、95%醇提物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物5種不同提取物對Caco-2細(xì)胞活力的影響及對Caco-2細(xì)胞上麥芽糖酶、蔗糖酶、乳糖酶3種二糖酶活性的抑制作用。結(jié)果表明，5種不同提取物中除95%醇提物對Caco-2細(xì)胞活力產(chǎn)生一定影響外，其余4種提取物對Caco-2細(xì)胞基本無毒性，在200 mg·L-1濃度提取物范圍內(nèi)培養(yǎng)24 ~ 72 h后細(xì)胞仍能保持較高活力；對3種二糖酶活性抑制作用效果最好的為醇提后的水提物，尤其是對蔗糖酶和乳糖酶的抑制作用更為明顯，最高的抑制率分別達(dá)到76.35%和60.13%，其次為乙酸乙酯萃取物，對乳糖酶的抑制率最高達(dá)54.41%。從青錢柳葉不同方法提取物的制備流程說明多糖類或中等極性的黃酮甙類有可能是青錢柳葉中抑制二糖酶活性的主要組成成分。

青錢柳；Caco-2細(xì)胞；二糖酶活性；麥芽糖酶；蔗糖酶；乳糖酶

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，高血壓、高血脂、高血糖即“三高”人群的數(shù)量也在逐年增加，嚴(yán)重威脅人類的身體健康。特別是糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）已成為繼心腦血管、腫瘤之后的重大非傳染性流行病的第三大殺手。據(jù)統(tǒng)計，2011年全球糖尿病患者已達(dá)3.7億人，預(yù)計到2030年將達(dá)5.5億人[1]。由于引起糖尿病的病因十分復(fù)雜，治愈難度大，糖尿病患者往往需要長期或終身服用藥物來控制病情，但目前臨床上使用的化學(xué)藥物若長久服用會產(chǎn)生如肝臟損害、嚴(yán)重低血糖、過敏性休克等副作用[2]。因此，研究目標(biāo)逐漸轉(zhuǎn)移到一些降糖植物上，從植物中開發(fā)毒副作用小的新型降糖藥。眾多臨床實踐和大量研究也表明從植物中得到的一些提取物可以明顯改善糖、脂代謝，在治療糖尿病及其并發(fā)癥中發(fā)揮著獨特的作用[3-6]。

青錢柳系胡桃科Juglandaceae青錢柳屬植物，為我國特有，是冰川世紀(jì)幸存下來的珍貴樹種[7]。民間常取其葉作代茶飲，具有清熱解毒、防病治病等功效[8]。目前國內(nèi)外對青錢柳的化學(xué)成分和藥理作用的研究已取得很大進(jìn)展，研究表明青錢柳中含有豐富的天然藥用成分，其結(jié)構(gòu)類型主要有多糖、黃酮、酚類、萜類、皂苷、有機(jī)酸、微量元素等[9-15]，許多研究證實青錢柳具有明顯的降血糖[16-17]、降血壓[18]、降血脂[19-20]、抗氧化[21-22]、抗腫瘤[23-24]和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能[25-26]等作用。特別是在糖尿病防治方面功效顯著，已有研究表明青錢柳中的多糖、黃酮、微量元素等化學(xué)成分都具有良好的降血糖作用[27-29]。

糖類是人體所需的主要能量來源之一，食物中的淀粉等多糖均需在消化道內(nèi)先分解為二糖，再經(jīng)存在于小腸黏膜刷狀邊緣處的二糖酶（蔗糖酶、麥芽糖酶、乳糖酶等）等作用分解為單糖后，才能被小腸上皮細(xì)胞吸收進(jìn)入血液循環(huán)[30]。人體對碳水化合物的利用吸收依賴于這些酶的活性，當(dāng)這些酶的活性被抑制后，就可以延緩葡萄糖在腸道的吸收，從而起到控制并有效地降低血糖的作用[31]。有研究表明青錢柳黃酮和青錢柳多糖對α-葡萄糖苷酶有很強(qiáng)的抑制活性，能和酶迅速結(jié)合并抑制其活性，從而降低糖尿病小鼠的空腹血糖[32-34]。為了進(jìn)一步研究青錢柳降血糖的作用機(jī)制及活性組分的篩選，本試驗采用Caco-2細(xì)胞模型，分析青錢柳葉的不同提取物對麥芽糖酶、蔗糖酶、乳糖酶3種二糖酶活性的抑制效果，以期為青錢柳葉的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器設(shè)備

供試青錢柳葉采自浙江省遂昌縣王村口鎮(zhèn)山井村，119°04′53″ E，28°20′49″ N，海拔1 059 m，系人工種植5年生苗。采集時間為2016年9月底，每片復(fù)葉除葉片頂端保留2 ~ 3片小葉外其余葉片全部摘取，所采鮮葉經(jīng)自然干燥后經(jīng)100℃高溫處理3 ~ 5 min，冷卻后裝于塑料袋內(nèi)保存，實驗前用粉碎機(jī)粉碎至80目備用。

Caco-2細(xì)胞ATCC#HTB-37購自于American Type Culture Collection，ATCC；胎牛血清SH30070.03（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS）、DMEM培養(yǎng)基SH30243.01B（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）、青霉素（Penicillin）/鏈霉素（Streptomycin）雙抗SV30010、磷酸鹽緩沖液SH30256.01（Phosphate Buffered Salin，PBS）、胰蛋白酶SH30042.01B均購自美國Hyclone公司；葡萄糖測定試劑盒購自北京索萊寶科技股份有限公司；BCA法蛋白定量試劑盒、MTT檢測試劑盒均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；乙二胺四乙酸（Ethylenediamine Tetraacetic Acid，EDTA）、二甲基亞砜（DMSO）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇、正丁醇、石油醚、乙酸乙酯等試劑均為國產(chǎn)分析純，購自杭州匯普化工儀器有限公司。

其它儀器還有酶標(biāo)儀（Thermo Scientific，USA），二氧化碳培養(yǎng)箱（日本三洋SANYO公司），冷凍離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司），恒溫振蕩培養(yǎng)箱（太倉華美生化儀器有限公司），真空冷凍干燥機(jī)（美國Labconco公司，F(xiàn)reeZone 2.5升），RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），DLSB-1005低溫冷卻液循環(huán)泵（杭州大衛(wèi)科教儀器有限公司），HH-ZK1數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），移液槍、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Thermo Scientific，USA）。

1.2 試驗方法

1.2.1 青錢柳葉提取物的制備

1號樣品：稱取100 g備用青錢柳粉，加8 ~ 10倍的蒸餾水于90℃水浴回流提取2次，每次1 h，合并濾液后減壓濃縮，最后冷凍干燥得青錢柳葉水提取物。

2號樣品：稱取1 000 g備用青錢柳粉，加10倍95%乙醇于80℃水浴回流提取2次，每次1 h，合并濾液后減壓濃縮至膏狀，取約一半膏狀物揮干溶劑后進(jìn)行冷凍干燥得青錢柳葉95%乙醇提取物；

3號樣品：將上述經(jīng)醇提后的藥渣晾干后，取100 g加8 ~ 10倍蒸餾水90℃水浴回流提取2次，每次1 h，合并濾液后減壓濃縮，最后冷凍干燥得青錢柳葉醇提后的水提物；

4號樣品：用上述95%乙醇提取物濃縮至膏狀的剩余樣品，加適量蒸餾水混勻經(jīng)石油醚萃取后，用乙酸乙酯萃取3 ~ 4次，合并萃取物，減壓濃縮，揮干溶劑后進(jìn)行冷凍干燥，得青錢柳葉乙酸乙酯萃取物；

5號樣品：將上述經(jīng)乙酸乙酯萃取后的剩余物再用正丁醇萃取3 ~ 4次，合并萃取物，減壓濃縮，揮干溶劑后進(jìn)行冷凍干燥，得青錢柳葉正丁醇萃取物。

青錢柳葉不同提取物的制備流程見圖1。

圖1 青錢柳葉不同提取物的制備流程

Figure 1 Preparation of different extracts fromleaves

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) Caco-2細(xì)胞株在37℃，5% CO2濃度條件下在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，DMEM培養(yǎng)基，內(nèi)含10%胎牛血清、100 IU·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素，在T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)3 d后即可生長至80% ~ 90%瓶底面積，然后使用含EDTA胰酶進(jìn)行消化，按照1:3或1:5的比例傳代。

1.2.3 青錢柳葉提取物對Caco-2細(xì)胞的毒性試驗 采用MTT法檢測青錢柳葉5種提取物在200 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)對Caco-2細(xì)胞毒性的影響。收集培養(yǎng)的對數(shù)生長期Caco-2細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，以每孔103~ 104個細(xì)胞數(shù)接種到96孔板（每孔體積200 μL）；將上述青錢柳葉提取物樣品按照200，100，50，25 mg·L-1（DMSO溶解）終濃度加入孔中，對照（CK）組加入DMSO，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，48 h，72 h后，每孔加MTT溶液（5 mg·mL-1用PBS 配）20 μL，繼續(xù)孵育4 h；終止培養(yǎng)后小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，于570 nm波長處在酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收值，根據(jù)各吸光度值計算出細(xì)胞活力，計算公式如下：

細(xì)胞活力（%）=（1－0））/（2－0）×100

式中，1為樣品組的吸光度，2為對照組的吸光度，0為空白。

1.2.4 青錢柳葉提取物對Caco-2細(xì)胞二糖酶活性的抑制試驗 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以每孔103~ 104個細(xì)胞數(shù)量接種到96孔板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)至形成致密單層（約15 ~ 21 d）后，吸去上清液，用PBS緩沖液沖洗3次，除去細(xì)胞表面附著物。試驗分CK組和樣品組，CK組每孔加入0.7 mL PBS緩沖液；樣品組每孔加入0.5 mL含28 mmol?L-1的麥芽糖/蔗糖/乳糖PBS緩沖液和0.2 mL樣品溶液，使各樣品的終濃度為200，100，50，25 mg·L-1，于37℃，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 min，并充分震蕩，立即冰浴結(jié)束反應(yīng)，利用葡萄糖測定試劑盒測定上清液中葡萄糖含量。收集細(xì)胞并提取總蛋白，用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測定總蛋白含量，按下式計算二糖酶活性：

二糖酶活性=（反應(yīng)后葡萄糖含量－反應(yīng)前葡萄糖含量）/180.2×總蛋白含量×反應(yīng)時間

各樣品對二糖酶活性的抑制率：抑制率（%）=（二糖酶活性對照組－二糖酶活性樣品組）/二糖酶活性對照組×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

各組試驗均重復(fù)3次，取平均值，試驗數(shù)據(jù)采用Excel表進(jìn)行繪圖和SPSS 17.0軟件進(jìn)行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取物對Caco-2細(xì)胞活力的影響

青錢柳葉不同提取物不同濃度培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞24 h，48 h，72 h后細(xì)胞活力試驗結(jié)果見圖2。

注：* ， # ，& 分別表示24 h，48 h，72 h處理下各濃度樣品與CK間有極顯著性差異（P<0.01）。

Figure 2 Effect of different concentration of extracts on cell viability

從圖2可以看出，1號樣品細(xì)胞活力較高的為25 mg·L-1濃度培養(yǎng)72 h，48 h，分別達(dá)到123.07%和103.32%（圖2A），極顯著大于CK（<0.01），說明低濃度下1號樣品對細(xì)胞生長不但沒有毒性，反而具有促進(jìn)作用，其它培養(yǎng)條件下細(xì)胞活力雖小于CK，但大部分都在65%以上，說明1號樣品在所試驗的濃度段內(nèi)對細(xì)胞活力的影響較?。?號樣品在不同濃度和不同時間處理下其細(xì)胞活力均極顯著低于CK（<0.01）（圖2B），除25，50，100 mg·L-1濃度下培養(yǎng)72 h其細(xì)胞活力大于50%外，其余均在50%以下，說明2號樣品對Caco-2細(xì)胞活力的影響相對較大；3號樣品在試驗范圍內(nèi)細(xì)胞活力均達(dá)到50%以上（圖2C），最高的為25，50 mg·L-1濃度下培養(yǎng)48 h，細(xì)胞活力達(dá)到121.05%和120.47%，極顯著大于CK（<0.01）；4號樣品（圖2D）和5號（圖2E）樣品與3號樣品相似，除了高濃度下培養(yǎng)72 h時間其細(xì)胞活力稍低外，其余均達(dá)到80%以上，有的甚至大于CK，說明4號、5號樣品和3號樣品一樣對細(xì)胞基本無毒性。綜上所述，5種樣品中除2號樣品對細(xì)胞活力有一定影響外，其余4種樣品在試驗濃度范圍內(nèi)（≤200 mg·L-1）對Caco-2細(xì)胞活力無明顯抑制作用，基本無毒性。

2.2 不同提取物對Caco-2細(xì)胞二糖酶活性的抑制作用

青錢柳葉不同提取物對Caco-2細(xì)胞3種二糖酶的抑制作用試驗結(jié)果見表1。

表1 青錢柳葉提取物不同濃度對二糖酶活性的抑制率

從表1可以看出，1號樣品對3種二糖酶活性的抑制作用僅在低濃度25 mg·L-1處理下才有所體現(xiàn)，抑制作用最好的為乳糖酶，抑制率為22.79%，其次為麥芽糖酶，抑制率為9.98%；2號樣品對3種二糖酶活性的抑制作用均不明顯，最高的也僅為4.56%，這可能與上面試驗結(jié)果中的2號樣品對細(xì)胞活力有一定影響有關(guān)；對3種二糖酶活性抑制作用效果最好的為3號樣品，對蔗糖酶和乳糖酶的抑制作用更為明顯，最高的為25 mg·L-1濃度處理，分別達(dá)到76.35%和60.13%，且隨濃度的增大抑制率逐漸降低，而對麥芽糖酶抑制率最高（21.65%）的為100 mg·L-1濃度處理，在其它濃度處理下也表現(xiàn)出不同程度的抑制作用；4號樣品對乳糖酶的抑制作用好于麥芽糖酶和蔗糖酶，抑制作用最好的為100 mg·L-1濃度處理，抑制率為54.41%；5號樣品在100 mg·L-1濃度處理下對乳糖酶的抑制作用表現(xiàn)最好，抑制率為42.51%，而對其它2種二糖酶活性的抑制作用僅在低濃度條件下才有所體現(xiàn)，在高濃度條件下則無抑制作用。

3 結(jié)論與討論

本實驗利用Caco-2細(xì)胞模型，模擬小腸吸收葡萄糖，研究了青錢柳葉的不同提取物對3種二糖酶的抑制作用。試驗結(jié)果表明，5種提取物中除2號樣品（95%醇提物）對Caco-2細(xì)胞具有一定毒性，影響其細(xì)胞活力外，其余4種樣品對細(xì)胞基本無毒性，在200 mg·L-1濃度范圍內(nèi)培養(yǎng)24 ~ 72 h后細(xì)胞仍能保持較高的活力；對3種二糖酶活性抑制作用效果最好的為3號樣品，尤其是對蔗糖酶和乳糖酶的抑制作用更為明顯，最高抑制率分別達(dá)到76.35%和60.13%，其次為4號樣品，對乳糖酶的抑制率最高達(dá)54.41%。

藥用植物中，具備抗α-葡萄糖苷酶活性的有效成分主要由多酚、黃酮及黃酮苷、生物堿、三萜及其苷類、肽類、酯類、酸類等組成[35]。由于天然產(chǎn)物的組成成分及結(jié)構(gòu)相當(dāng)復(fù)雜，系統(tǒng)分離法的目的是按照相似相容原理，利用溶劑極性大小對有機(jī)成分進(jìn)行分類提取，得到成分相似的不同組分，再分別進(jìn)行藥效試驗，確定該部分是否有效，找出關(guān)鍵成分。水作為強(qiáng)極性溶劑常用于提取極性很大的甙類、糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、小分子有機(jī)酸等；乙醇作為親水性有機(jī)溶劑，除了蛋白質(zhì)、粘液、果膠、淀粉和部分多糖外，其它極性成分大部分都能溶解；乙酸乙酯和正丁醇作為中等和中等偏大極性的有機(jī)溶劑常用于提取中等極性的黃酮甙類和中等偏大極性的某些甙類（如皂甙、蒽酮甙等）。試驗分析表明，3號樣品為青錢柳葉經(jīng)95%乙醇提取后的水提物，對二糖酶活性的抑制作用效果明顯好于1號樣品（直接水提），其次為4號樣品和5號樣品（乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物），說明多糖類或中等極性的黃酮甙類有可能是青錢柳葉中抑制二糖酶活性的主要組成成分，多糖對于α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用的研究由來已久，早在2010年，張小芳等[36]也發(fā)現(xiàn)青錢柳粗多糖具有降血糖作用并對胰島組織有一定的保護(hù)作用。近年來，王小江等[37]發(fā)現(xiàn)青錢柳多糖CP50具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，而對于黃酮類成分，最新研究表明青錢柳總黃酮聯(lián)合多糖具有較好的的降血糖作用，并能改善糖尿病大鼠的肝腎功能和胰島素水平，聯(lián)合用藥效果優(yōu)于其單一用藥[38]。這些研究與本文采用的Caco-2細(xì)胞體外模擬小腸環(huán)境研究得出的結(jié)論是一致的。中等極性的黃酮類成分和水溶性多糖可能是青錢柳降血糖作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，而其確切的有效成分及作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Inhibition Effect of Extracts fromLeaf on Activity of Disaccharide in Caco-2 cells

WANG Li-ling1，BAI Ming-e1，LIU Ben-tong1，WANG Yan-bin1，XU Gao-fu2

（1. Zhejiang Academy of Forestry, Hangzhou 310023, China; 2. Chun’an Xin’anjiang Development Corporation of Zhejiang, Chun’an 311700, China）

Collection was carried out of leaves of 5-yearplanted in Suichang, Zhejiang province by the end of September 2016. Experiments were implemented on effect of water extract, water extract after alcohol extraction, 95% alcohol extract, ethyl acetate extract and n-butyl alcohol extract from leaves ofon cell activity of caco-2 cells and inhibitory effects on activity of maltase, sucrose and lactase. The results showed that 95% alcohol extract had impact on the activity of caco-2 cells and the other four extracts had non-toxic to caco-2 cells. Water extract after alcohol extraction had the best inhibitory effect on the activity of disaccharide, especially on that of sucrose and lactase, with the highest inhibition rate of 76.35% and 60.13%, followed by ethyl acetate extract, with the highest inhibition rate of lactase of 54.41%.

; caco-2 cells; activity of disaccharides; maltase; sucrase; lactase

10.3969/j.issn.1001-3776.2019.01.005

S792；R285.5

A

1001-3776（2019）01-0028-07

2018-09-10；

2018-12-09

浙江省省屬科研院所扶持專項“葉用青錢柳定向培育技術(shù)研究與產(chǎn)品開發(fā)”（2017F30019）

王麗玲，副研究員，從事天然活性成分功能研究；E-mail:echo22239@163.com。

柏明娥，研究員，從事資源植物開發(fā)；E-mail:baiminge66@163.com。