劉 亞，王 盼，周鈺鴻，陳江芳，陳子林，唐光大

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浙江大盤山華頂杜鵑菌根真菌的分離和鑒定

劉 亞1，王 盼2，周鈺鴻2，陳江芳3，陳子林2，唐光大4

（1. 浙江省磐安縣風(fēng)景旅游管理局，浙江 磐安 322300；2. 浙江省大盤山國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，浙江 磐安 322300； 3. 磐安縣林業(yè)局，浙江 磐安 322300；4. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣東 廣州 510642）

于2016年5月在浙江省大盤山國家級自然保護(hù)區(qū)的3處采樣地，每處采集5株華頂杜鵑的1 ~ 2支側(cè)根，培養(yǎng)分離華頂杜鵑的菌根真菌，然后結(jié)合菌落形態(tài)特征和DNA ITS序列分析進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明：華頂杜鵑根系內(nèi)共分離到165個(gè)菌株，分為22個(gè)菌落形態(tài)類型；結(jié)合DNA ITS序列分析，最終分為20個(gè)不同的菌種類型，其中19個(gè)菌種類型屬于子囊菌門Ascomycota，包括8個(gè)屬于糞殼菌綱Sordariomycetes和6個(gè)屬于錘舌菌綱Leotiomycetes；3個(gè)優(yōu)勢菌種分別為，和某糞殼菌綱真菌的近緣種，分別占菌株總數(shù)的41.82%，22.42%和10.91%；其余17個(gè)菌種類型合計(jì)只占總數(shù)的24.85%。

華頂杜鵑；杜鵑花類菌根；菌根真菌分離；浙江大盤山

菌根是植物根系與部分土壤真菌形成的共生體，能夠協(xié)助植物吸收和利用養(yǎng)分，促進(jìn)植物對土壤營養(yǎng)元素的吸收，增強(qiáng)植物的抗逆性[1-2]。杜鵑花類菌根（Ericoid mycorrhiza，ERM）是一類特殊的內(nèi)生菌根，杜鵑花科Ericaceae植物在高山、石壁、沼澤[3]等生境均有分布，ERM對杜鵑花科植物的生態(tài)適應(yīng)可能起了重要的作用，同時(shí)也促進(jìn)了杜鵑花科植物在不同生境的物種分化和形成[4-6]。華頂杜鵑于1990年在浙江省天臺縣華頂山被發(fā)現(xiàn)[7]，新種發(fā)表時(shí)該物種被指定了2份模式標(biāo)本，2005年進(jìn)行了訂正[8]。該物種是浙江省特有植物，發(fā)現(xiàn)時(shí)僅有200余株，已于2012年4月被浙江省人民政府列入《浙江省重點(diǎn)保護(hù)野生植物名錄（第一批）》。近年來，在浙江省磐安大盤山、寧波四明山、金華北山、寧波奉化等地也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了華頂杜鵑，但種群數(shù)量小，屬于衰退型[9]，整體遺傳多樣性水平低[10-11]。華頂杜鵑主要生長在海拔750 ~ 1 150 m的光照較強(qiáng)的陽坡，土壤干旱貧瘠，菌根對其適應(yīng)生境可能有一定的貢獻(xiàn)。本研究采用人工培養(yǎng)根段分離菌株、菌落形態(tài)分類和菌株DNA ITS序列分子鑒定等方法調(diào)查華頂杜鵑菌根群落的真菌種類，并找出其優(yōu)勢菌種，為該物種的幼苗繁殖、遷地保護(hù)、壯苗培育和后期開發(fā)利用等提供研究基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 根系樣品采集

浙江省大盤山國家級自然保護(hù)區(qū)位于浙江中部的磐安縣，是我國目前唯一以野生藥用生物資源為主要保護(hù)對象的國家級自然保護(hù)區(qū)。保護(hù)區(qū)為亞熱帶季風(fēng)氣候，以常綠闊葉林為地帶性植被，年平均氣溫為13.9 ~ 17.4℃，年均降水量1 427.8 mm，年均日照1 827.6 h，年均無霜期192 d，年均結(jié)冰期47 d，土壤主要有紅壤、黃壤、水稻土，是華頂杜鵑在其模式產(chǎn)地之外發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)自然分布點(diǎn)[12]。2016年5月在保護(hù)區(qū)內(nèi)海拔800 ~ 1 000 m的牛角尖（120°31￠18.62E，28°58￠14.72N）、高姥山（120°32￠41.62E，28°53￠43.82N）、毛塢（120°31￠52.302E，28°59￠7.72N）3處采樣地，每處采集5株華頂杜鵑的根系，每株采集1 ~ 2支側(cè)根，將側(cè)根連同側(cè)根上的細(xì)根和泥土一起，保濕置于冰壺內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。

菌根分離培養(yǎng)基采用改良的馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基[13]，配方為：葡萄糖10 g、胰蛋白胨5 g、磷酸氫二鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、孟加拉紅0.033 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至5.0，然后121℃高壓滅菌20 min，冷卻至60℃以下時(shí)加入0.03 g鏈霉素混合均勻。

菌落形態(tài)觀測采用pH值調(diào)節(jié)為5.0的MEA培養(yǎng)基，配方為麥芽提取物20 g、胰蛋白胨1 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值至5.0，然后121℃高壓滅菌20 min，冷卻至60℃以下時(shí)加入0.03 g鏈霉素。試驗(yàn)所用的葡萄糖、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、孟加拉紅、瓊脂均為分析純；胰蛋白胨、麥芽提取物為生物試劑（英國Oxoid公司生產(chǎn)）。

1.2 菌種分離和觀測

采用根段直接培養(yǎng)法進(jìn)行菌根分離。清洗和挑選直徑在1.0 mm以下的細(xì)根，在超凈工作臺下置于75%乙醇中，浸泡15 s，無菌水漂洗3 ~ 5次；再在10 %的家用84消毒液中浸泡15 min，無菌水漂洗3 ~ 5次。把根系剪成長約0.5 cm的小段，用無菌濾紙吸干水滴，每個(gè)平板5條根段，置于分離培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用接種棒蘸取少量最后一遍漂洗根系的無菌水，均勻涂抹于一個(gè)平板，作為對照，排除雜菌。把培養(yǎng)根段和對照的平板置于25℃培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)14 ~ 28 d。每個(gè)樣地分別培養(yǎng)60個(gè)根段。試驗(yàn)所用75%乙醇為分析純；家用84消毒液選用藍(lán)月亮牌84消毒液，有效成分為次氯酸鈉，有效含氯量8 000 ~ 10 500 mg·L-1。

待菌落從根段中長出，用接種針挑取菌絲，置于MEA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)7 d后，觀察菌落形態(tài)的一致性和均勻性。若菌落形態(tài)有差異，進(jìn)行二次分離，如此反復(fù)直至純化。把純化后的菌株接種至MEA培養(yǎng)基上，置于25℃培養(yǎng)箱中，黑暗培養(yǎng)3個(gè)星期。根據(jù)菌落形態(tài)特征進(jìn)行描述記錄和分類，測量指標(biāo)包括菌落直徑、顏色、質(zhì)地、邊緣、是否有液體分泌物等[14-16]。

1.3 菌株分子鑒定

從每一個(gè)菌落形態(tài)類型中根據(jù)所擁有菌株的數(shù)量多少隨機(jī)挑選部分菌株進(jìn)行DNA ITS序列分析。菌株DNA提取參考莊彩云等[17]的方法。

DNA ITS區(qū)段的PCR擴(kuò)增采用通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）。PCR反應(yīng)體系為2×PCR Buffer（Mg2+，dNTP plus）（TaKaRa）12.5 μL，引物各0.8 μL，DNA模板1 μL，rTaq酶（1.25 U·μL-1）（TaKaRa）0.5 μL；ddH20定容至25 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為：98℃預(yù)變性3 min，98℃變性30 s，50℃退火30 s，68℃延伸1 min，68℃延伸7 min，38個(gè)反應(yīng)循環(huán)。

PCR產(chǎn)物純化后送至杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司直接測序。把得到的序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），進(jìn)行Blast相似性比對，選取并下載相似度排在前列的序列。在MEGA6軟件中用ClustalW程序進(jìn)行序列比對和人工校正，對比對后的序列矩陣采用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）和貝葉斯推理法（Bayesian inference，BI）進(jìn)行分析，ML采用CIPRES（https://www.phylo.org/portal2/home.action）中的RAxML-HPC2 on XSEDE（8.2.10）程序分析，在Bootstrapping phase中選擇GTRGAMMA模型，用Bootstrap自檢檢驗(yàn)法進(jìn)行評估，1 000次重復(fù)；BI采用MrBayes on XSEDE（3.2.6）程序分析，在篩選出最優(yōu)模型的情況下，馬科夫鏈-蒙特卡洛值（Markov chain Monte Carlo，MCMC）分別取10 000 000、抽樣頻率為100；計(jì)算值分裂頻率平均標(biāo)準(zhǔn)差（Average standard deviation of spl-it frequencie）值小于0.01為止，并計(jì)算各分支的后驗(yàn)概率值（Posterior probability，PP），獲得BI拓?fù)錁洹?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)特征觀測

3個(gè)采樣地的華頂杜鵑根系內(nèi)共分離到165個(gè)菌株，其中牛角尖采樣地66個(gè)，高姥山采樣地50個(gè)，毛塢采樣地49個(gè)。依據(jù)菌株在MEA培養(yǎng)基上25℃黑暗條件下培養(yǎng)21 d的菌落形態(tài)特征，分離得到的菌株分為22個(gè)類型。其中7個(gè)類型的菌落顏色屬于白色、乳白、淡黃色等淺白色系，13個(gè)類型的菌落顏色屬于淺灰、灰、深灰、深褐、青棕、黑等深灰色系，2個(gè)類型的菌落顏色正面是淺白色系，背面是深灰色系；15個(gè)類型的菌落質(zhì)地呈絨氈狀，4個(gè)類型的菌落質(zhì)地呈薄蠟狀，3個(gè)類型在兩者之間；2個(gè)類型的菌落在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)透明狀的分泌物（圖1，表1）。

圖1 菌落形態(tài)特征分類

Figure 1 Colonial morphological characteristics of mycorrhizal fungi

表1 菌落形態(tài)特征分類

2.2 菌株的rDNA ITS序列分析

從22個(gè)菌落形態(tài)類型的165個(gè)菌株中挑選了43個(gè)菌株進(jìn)行DNA ITS序列分析，每個(gè)類型1 ~ 7個(gè)代表菌株，PCR擴(kuò)增得到的ITS序列長度范圍在487 ~ 679 bp之間。把所獲得的序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，選取相似度高于93%的數(shù)據(jù)庫序列（表2），并以親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)的裂褶菌（Genbank登錄號EF155505.1）為外類群[14]，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。

表2 菌株的rDNA ITS序列BLAST結(jié)果

表2 續(xù)

菌落形態(tài)類型菌株編號親緣關(guān)系最近的菌種Genbank登錄號比對覆蓋率/%序列相似率/% T13D-7-2；G-10-1；G-4-3；Z-3-2；Z-4-4；Z-6-2；Z-9-3Ilyonectria radicicolaFJ481036.110099 T14D-1-1；D-6-2；D-7-6Paraphaeosphaeria neglectaJX496038.110099 T15Z-5-1；Z-6-3Ascomycota sp.KP689247.110099 T16D-1-4；D-10-3Pezicula ericaeKX440131.110099 T17D-10-1；G-9-2；Z-7-3；Z-9-1Sordariomycetes sp.KF428561.19499 T18D-9-3Ericoid mycorrhizal sp.AY046402.16994 Helotiales sp.KC180690.16494 T19G-8-3Sordariomycetes sp.AB847015.1100100 T20G-4-5Sordariomycetes sp.KF428561.49499 T21D-1-2；G-10-2；Z-4-1；Z-10-2Phialocephala fortiniiEU888627.19999 T22Z-6-5Uncultured Cladophialophora cloneFJ440877.19899

圖2顯示，利用ML和BI構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致。43個(gè)代表菌株聚為20個(gè)分支。屬于同一菌落形態(tài)類型T1的菌株D-1-5，D-5-2和T2的D-10-2，Z-10-1在ML系統(tǒng)發(fā)育樹中各自聚為4個(gè)不同的分支。而不同菌落形態(tài)類型T5，T12，T17，T20的菌株在ML系統(tǒng)發(fā)育樹中聚為1個(gè)分支，T4，T7的菌株聚為1個(gè)分支。其余不同菌落形態(tài)類型的菌株在ML系統(tǒng)發(fā)育樹中各自聚為1個(gè)分支。

圖2 基于菌株及其相似真菌的rDNA ITS序列構(gòu)建的ML和BI系統(tǒng)發(fā)育樹（節(jié)點(diǎn)的數(shù)值分別代表PP和BPML）

Figure 2 ML and BI phylogenetic tree based onDNA ITS sequences of mycorrhizal fungi and similar fungi from the Genbank

2.3 菌根真菌鑒定結(jié)果

結(jié)合菌落形態(tài)分類和代表菌株的DNA ITS序列分析結(jié)果，此次菌根分離得到165個(gè)菌株為20個(gè)不同的菌種類型（表3）。除了1個(gè)菌種類型N8的分類地位尚不清楚，其余19個(gè)菌種類均屬于子囊菌門Ascomycota，其中8個(gè)屬于糞殼菌綱Sordariomycetes，6個(gè)屬于錘舌菌綱Leotiomycetes。

表3 菌根真菌鑒定結(jié)果及菌株數(shù)量統(tǒng)計(jì)

3個(gè)菌種類型N7，N13 和N19的菌株數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他菌種類型，分別為18，37和69個(gè)，占菌株總數(shù)的75.15%，是華頂杜鵑菌根的優(yōu)勢菌種類型。其余17個(gè)菌種類型的菌株數(shù)量在1 ~ 7個(gè)之間，只占菌株總數(shù)的24.85%。

3 結(jié)論

從浙江省大盤山國家級保護(hù)區(qū)的華頂杜鵑的根系內(nèi)，采用人工培養(yǎng)根段的方法分離到165個(gè)菌株，分為22個(gè)菌落形態(tài)類型。結(jié)合DNA ITS序列分析，華頂杜鵑的菌根真菌可分為20個(gè)不同的菌種類型，其中19個(gè)菌種類型屬于子囊菌門，1個(gè)未能鑒定類別。

糞殼菌綱和錘舌菌綱的真菌占了華頂杜鵑菌根真菌的大多數(shù)，8個(gè)菌種類型的71個(gè)菌株屬于糞殼菌綱，分別占菌種類型總數(shù)和菌株總數(shù)的40%和43.03%；6個(gè)菌種類型的77個(gè)菌株屬于錘舌菌綱，分別占菌種類型總數(shù)30%和菌株總數(shù)的46.67%。優(yōu)勢菌種為，和某糞殼菌綱真菌的近緣種，分別占菌株總數(shù)的41.82%，22.42%和10.91%；其余菌種的菌株數(shù)量較少，17個(gè)菌種類型合計(jì)只占總數(shù)的24.85%。

4 討論

4.1 真菌形態(tài)鑒定和分子鑒定方法的比較

真菌種類繁多、形態(tài)特征復(fù)雜，并且其形態(tài)特征常隨著環(huán)境變化或菌落生長而變化，因此傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定方法難度較大。分子鑒定方法以真菌物種的DNA ITS序列為依據(jù)，雖然可以定量地分析，但分子試驗(yàn)價(jià)格昂貴，對一些特殊的菌種類型可能難以靠通用引物進(jìn)行鑒別，依賴Genbank等數(shù)據(jù)庫中已有同源或近緣菌株的序列信息，并且選取合適的方法和模型進(jìn)行分子數(shù)據(jù)分析非常重要[18]。

本研究中由于一些菌落形態(tài)特征較難判定，因而對菌落形態(tài)分類進(jìn)行得較為細(xì)致，把一些有細(xì)微差異的菌株都分為了不同的菌落形態(tài)類型，并且選取了較多的菌株進(jìn)行DNA ITS序列分析，最終將其中6個(gè)菌落形態(tài)類型經(jīng)過分子鑒定后被歸并為2個(gè)不同菌種，而4個(gè)被歸為2個(gè)菌落形態(tài)類型的菌株經(jīng)過分子鑒定后發(fā)現(xiàn)是4個(gè)差異較大的菌種，其余菌株的形態(tài)分類和分子分類的結(jié)果一致?？梢婋m然菌落形態(tài)分類存在一定誤差，但它可作為挑選代表菌株進(jìn)行分子鑒定的重要參考，從而節(jié)約分子試驗(yàn)成本。通過較為細(xì)致的菌落形態(tài)分類和選取較多的菌株進(jìn)行分子鑒定，可以修正菌落形態(tài)分類的誤差，從而對大量真菌進(jìn)行較為準(zhǔn)確的鑒定。由于Genbank數(shù)據(jù)庫中序列信息有限，本研究中3個(gè)菌種類型N4，N8，N17并未找到序列相似率在99%以上的株，這些菌種類型的鑒定結(jié)果與其準(zhǔn)確的系統(tǒng)分類地位應(yīng)該還有一定差距；4個(gè)菌種類型N3，N7，N15，N18雖然分別找到了序列相似率99%的菌株，但僅能鑒定到目或目以上。而除此之外的13個(gè)菌種類型，則相對準(zhǔn)確地鑒定到了屬或種。

4.2 華頂杜鵑菌根群落真菌組成

隨著研究技術(shù)的進(jìn)步，越來越多的子囊菌門和擔(dān)子菌門真菌在杜鵑花科植物的根內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，包括sp.，sp.，sp.，枝頂孢屬sp.，sp.，sp.，sp.，粒毛盤菌屬sp.等子囊菌類和sp.，Sebacinales，Serendipitaceae，等擔(dān)子菌類，其中子囊菌門盤菌屬sp.，sp.和樹粉孢屬sp.是最常見的杜鵑花類菌根真菌，已被證實(shí)能與杜鵑花科植物的根系形成典型的胞內(nèi)菌絲節(jié)結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行直接的營養(yǎng)交換[19]。本研究中菌種類型N4，N10和N16分別是，、（同）的同源或近緣種，但它們分別只占菌株總數(shù)的3.64%，1.21%和2.42%，并未在大盤山地區(qū)華頂杜鵑的菌根群落里占優(yōu)勢。本研究中優(yōu)勢菌種類型N3，N13和N7分別是，和某種未知糞殼菌綱Sordariomycetes真菌的同源或同一種，分別占菌株總數(shù)的41.82%，22.42%和10.91%。大量研究表明，以為典型代表的深色有隔內(nèi)生真菌（Dark septate endophytes，DES）在包括杜鵑花科[20]、松科Pinaceae[21]，蘭科Orchidaceae[22]，豆科Leguminosae[23]在內(nèi)的多種植物的菌根內(nèi)都有發(fā)現(xiàn)是一種幾乎沒有宿主選擇性的廣譜性菌根真菌，并且對宿主植物具有積極的菌根效益[24]是南美洲巴塔哥尼亞地區(qū)（Patagonia）的杜鵑花科白珠樹屬麗果木.和波比白珠樹.的侵染率較高的菌根真菌之一[25]，在云南高黎貢山的大樹杜鵑.var.的根內(nèi)也曾分離和記錄過，并且是大樹杜鵑部分菌根群落的優(yōu)勢菌種類型[26]。然而，.及該屬的真菌常對葡萄[27]、鱷梨[28]等多種植物引起嚴(yán)重的根腐病。有研究觀點(diǎn)提出，植物與真菌之間的互利共生或致病寄生關(guān)系并沒有絕對的界限，而是受環(huán)境、生理、基因等多種因素的影響；在特定的條件下，植物與真菌之間的互利共生或致病寄生關(guān)系可以相互轉(zhuǎn)化[29]。.未對華頂杜鵑，麗果木、波比白珠樹和大樹杜鵑等杜鵑花科植物引起病害，同時(shí)這些杜鵑花科植物的自然分布區(qū)都非常狹小、生境環(huán)境特殊。這些杜鵑花科植物是否具有抵抗根腐病的特殊機(jī)理，或者.對這些杜鵑花科植物適應(yīng)特殊環(huán)境是否具有關(guān)鍵性作用，可做進(jìn)一步研究和探索。

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Isolation and Identification of Mycorrhizal fungi inRoot in Zhejiang Dapanshan National Nature Reserve

LIU Ya1，WANG Pan2，ZHOU Yu-hong2，CHEN Jiang-fang3，CHEN Zi-Lin2，TANG Guang-da4

（1. Pan’an Administration of Tourism of Zhejiang, Pan’an 322300, China; 2. Administration of Dapanshan National Natural Reserve of Zhejiang, Pan’an 322300, China; 3. Pan’an Forestry Bureau of Zhejiang, Pan’an 322300, China; 4. College of Forestry and Landscape Architecture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China）

Three sample plots were established in Dapanshan National Nature Reserve, Zhejiang province in May of 2016. 5were selected for 1-2 lateral roots each. Ericoid mycorrhiza (ERM) was cultured from collected roots and studied by morphological characteristics and molecular identification ofDNA ITS sequence. The result showed that 165 mycorrhizal fungal strains were isolated which were classified into 22 types based on colony characteristics.DNA ITS demonstrated that these mycorrhizal fungi could be identified into 20 species, among them, 19 species belonging to Ascomycota, including 8 Sordariomycetes, 6 Leotiomycetes. The dominant 3 species were,andsp., respectively accounting for 41.82 %, 22.42% and 10.91% of the total strains. The lest 17 species occupied only 24.9%.

; ericoid mycorrhiza (ERM); Mycorrhizal fungi isolation; Dapanshan National Nature Reserve

10.3969/j.issn.1001-3776.2019.01.001

S685.21

A

1001-3776（2019）01-0001-08

2018-07-24；

2018-11-29

金華市重點(diǎn)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2017-2-022）資助

劉亞，工程師，從事植物生態(tài)與植物旅游開發(fā)利用研究工作；E-mail:785480407@qq.com。

唐光大，博士，副教授,從事植物資源和植物生態(tài)方面的研究；E-mail:gdtang@scau.edu.cn。