吳非，孫虓，欒嵐，李響，韓昱晨

（1沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科，沈陽 110024；2 中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一臨床學(xué)院病理科，沈陽 110001； 3沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院藥劑科，沈陽 110024；4上海市胸科醫(yī)院病理科，上海 200000）

有活性的蛋白激酶C受體1（receptor for activated C kinase1, RACK1），由GNB2L1基因編碼，分子量為36kDa。RACK1結(jié)構(gòu)中包含7個WD40重復(fù)序列，相關(guān)報道提示RACK1的WD40重復(fù)序列正是RACK1與眾多蛋白相互作用的基礎(chǔ)[1]。RACK1主要分布在細胞質(zhì)和細胞膜中，為多種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用提供支架，從而涉及多種信號傳導(dǎo)途徑。RACK1可以調(diào)節(jié)許多細胞的作用，包括細胞生長、分化、粘附、遷移和免疫[2,3]。微小染色體維持蛋白7（minichromosome maintenance protein 7，MCM7）是微小染色體維持（minichromosome maintenance，MCM）蛋白家族的成員，對維持MCM復(fù)合體的螺旋酶活性有重要意義，對于真核細胞中DNA復(fù)制和增殖的啟動至關(guān)重要。本團隊前期研究中，使用酵母雙雜交篩選鑒定MCM7為RACK1結(jié)合蛋白之一。RACK1是MCM7相互作用蛋白。蛋白激酶C激活的特征是由胞質(zhì)轉(zhuǎn)至胞膜或細胞骨架，這一轉(zhuǎn)位依賴于RACK1蛋白。RACK1缺乏的細胞運動能力減弱。RACK1促進細胞增殖[4]。那么RACK1與MCM7在各類型肺癌組織中如何表達，是否可以應(yīng)用于臨床病理診斷及指導(dǎo)預(yù)后，尚需進一步研究證實。本研究應(yīng)用免疫組化實驗檢測MCM7與RACK1在各類型肺癌中表達，并探討二者與肺癌臨床病理因素間關(guān)系。

材料與方法

1 標(biāo)本

收集中國醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院及沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院病理科2008年1月至2016年12月手術(shù)切除的原發(fā)灶及相應(yīng)癌旁正常肺組織石蠟塊，包括肺腺癌150例，肺鱗癌150例，肺大細胞癌20例和肺小細胞癌50例。

2 試劑

鼠單克隆抗體 RACK1購自BD公司，鼠單克隆抗體MCM7購自Santa Cruz公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司。S-P免疫組化試劑盒（kit-9701）購自福州邁新生物科技開發(fā)有限公司。

3 免疫組織化學(xué)（S-P）法及判讀標(biāo)準(zhǔn)

石蠟切片置于60℃烘箱中烘烤2h，室溫冷卻后二甲苯脫蠟40min，梯度乙醇水化，蒸餾水沖洗5min×3次，后于pH6.0的檸檬酸鹽抗原修復(fù)液中高溫高壓修復(fù)2min，PBS沖洗5min×3次，加入3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶20min，PBS沖洗5min×3次，非免疫動物血清室溫孵育10min（以封閉特異性位點），去血清加一抗MCM7（1∶100）、RACK1（1∶200），4℃于冰箱孵育過夜；PBS沖洗5min×3次，加即用型廣譜試劑盒C液（鼠兔共用二抗）室溫孵育20min；PBS沖洗5min×3次，加即用型廣譜試劑盒D液，室溫20min；PBS沖洗5min×3次；DAB顯色，自來水終止顯色。蘇木素復(fù)染，自來水沖洗反藍，梯度酒精脫水，中性樹膠封片。

以肺癌細胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達，結(jié)合陽性細胞百分比及陽性細胞染色強弱兩個方面評分。MCM7、RACK1陽性表達根據(jù)陽性細胞百分率和染色程度進行半定量結(jié)果判定：無陽性細胞記0分，陽性細胞百分率≤50%記1分，51%～75%記2分，≥75%記3分；胞質(zhì)和/或細胞核基本不著色記0分，染色棕黃記1分，染色棕色記2分，染色褐色記3分。每張切片的陽性細胞百分率得分和染色程度等分兩項相加作為最后得分。總分0～1分記陰性（-），2～3分記為弱陽性（+），4～5分記為陽性（++），6分記為強陽性（+++）；以陰性至弱陽性為低表達，陽性至強陽性為高表達。

4 統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS（Statistical Package for Social Science）13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用χ2檢驗，雙變量相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析、生存分析采用Kaplan-Meier法等。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MCM7與RACK1在肺癌中表達高于癌旁正常肺組織

MCM7與RACK1在正常支氣管上皮中呈陰性或低表達，在肺癌中彌漫弱陽性或散在陽性表達；MCM7陽性定位于細胞核，RACK1陽性定位于細胞質(zhì)、膜（圖1）。MCM7與RACK1在肺癌中陽性率為89.5%（287/370）、88.9%（239/370），均明顯高于正常肺組織（MCM：χ2=12.608，P=0.000；RACK1：χ2=25.273，P=0.000）（圖1-圖3，表1）。

2 CM7與RACK1二者在肺癌中表達與臨床病理因素間關(guān)系

免疫組織化學(xué)統(tǒng)計學(xué)分析顯示，MCM7與RACK1的表達水平均與肺癌的病理分級（P=0.003，P=0.002）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.008，P=0.002）、組織學(xué)分類（P=0.000，P=0.000）和TNM分期（P=0.004，P=0.012）相關(guān)。二者與患者年齡（P=0.617，P=0.355）、性別（P=0.110，P=0.613）無相關(guān)性。MCM7高表達情況在鱗狀細胞癌（Squamous cell carcinoma，SCC，122/150，81.3%）、腺癌（Adenocarcinoma，ADC，93/150，62.0%）、大細胞癌（Large cell lung cancer，LCLC，6/20，30%）、小細胞癌（Small cell lung cancer，SCLC，23/50，46%）；在鱗癌、腺癌中表達明顯高于其他組織學(xué)類型；RACK1高表達情況在SCC（123/150，82.0%）、ADC（130/150，86.7%）、LCLC（8/20，35%）、SCLC（5/50，10%）；在鱗癌、腺癌中表達均明顯明顯高于其他組織學(xué)類型（表2）。

圖1 正常支氣管上皮、鱗狀上皮不典型增生和鱗癌中MCM7和RACK1表達的免疫組織化學(xué)檢測。A，MCM7在正常支氣管上皮呈陰性；B，RACK1在正常支氣管上皮低表達(*)，在鱗狀上皮不典型增生(**)和鱗癌(***)中的表達增強；比例尺，100μmFig. 1 Immunohistochemical exmination for expression of MCM7 and RACK1A in normal bronchial epithelium, squamous epithelial dysplasia and squamous cell carcinoma. A, MCM7 is negative in normal bronchial epithelial; B, RACK1 is weak in normal epithelium (*) and strong in squamous epithelial dysplasia (**) and squamous cell carcinoma (***); scale bar, 100μm

圖2 MCM7表達于癌細胞核。A，鱗癌；B，腺癌；C，大細胞癌；D，小細胞癌；比例尺，100μmFig. 2 MCM7 expression in the cancer cell nuclei; A, squamous cell carcinoma; B, adenocarcinoma; C, large cell carcinoma; D, small cell carcinoma;scale bar, 100μm

3 MCM7與RACK1高表達患者生存時間縮短

應(yīng)用Kaplan-Meier法分析MCM7、RACK1蛋白表達與各類型肺癌患者生存時間（P=0.006，P=0.002，Log-rank檢驗）的關(guān)系（圖4，圖5），顯示MCM7、RACK1高表達組（4-6分）生存時間明顯低于低表達組（0-3分）。

4 MCM7與RACK1在肺癌中的表達正相關(guān)

對肺癌免疫組化MCM7與RACK1蛋白表達應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者具有正相關(guān)性（r=0.401，P=0.000）(表 3）。

圖3 RACK1 表達于癌細胞質(zhì)和細胞膜。A，鱗癌；B，腺癌；C，大細胞癌；D，小細胞癌；比例尺，100μmFig. 3 RACK1 expression in cytoplasm and cell membrane of cancer cells. A, squamous cell carcinoma; B, adenocarcinoma; C, large cell carcinoma;D, small cell carcinoma; scale bar, 100μm

表1 MCM7和RACK1在肺癌和癌旁正常肺組織中的表達Tab. 1 Expression of MCM7 and RACK1 in lung cancer and adjacent normal lung tissues

討 論

MCM7為DNA復(fù)制許可復(fù)合體MCM的關(guān)鍵成員，在控制DNA復(fù)制的起始過程中起重要的作用，與細胞周期調(diào)控、轉(zhuǎn)錄、細胞增殖密切相關(guān)[5]，其在DNA復(fù)制調(diào)控中的重要作用已愈來愈引起人們的關(guān)注。已有的研究顯示，在多種腫瘤中MCM7表達升高，MCM7過度表達可以促進腫瘤生長。腦膜瘤中Ⅱ級MCM7蛋白表達水平高于Ⅰ級[6]。Guan等[7]發(fā)現(xiàn)乳頭狀尿路上皮腫瘤中MCM7表達隨著腫瘤分級的增加而升高。然而，Ishibashi等[8]研究表明MCM7是Dukes C期結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)的危險因素。體外研究表明，MCM7低表達顯著抑制食管癌細胞系中的細胞增殖，集落形成和遷移[9]。Kwok等[10]提示MCM2-7基因可能與乳腺癌中的常見轉(zhuǎn)錄因子（AML-1a，GATA-1，SRY）密切相關(guān)。Yang等[11]應(yīng)用免疫組織化學(xué)研究表明MCM7聯(lián)合Ki67可作為評價胃癌和癌前病變的更敏感的增殖指標(biāo)。

有報道顯示，MCM7在直徑小于3cm的肺腺癌中表達，與性別、組織學(xué)分級、組織學(xué)亞型、腫瘤大小顯著相關(guān)[12]。也有研究的免疫組織化學(xué)分析顯示，331名非小細胞肺癌中有196名MCM7陽性染色，而在各種正常組織中未觀察到顯著的染色，研究還發(fā)現(xiàn)MCM7表達升高與非小細胞肺癌患者預(yù)后不良相關(guān)[13]。 而本研究的結(jié)果表明MCM7在正常支氣管上皮不表達，在各種組織學(xué)類型肺癌組織中均有表達，MCM7高表達率在各類型肺癌中分別為SCC（122/150，81.3%）、ADC（93/150，62.0%）、LCLC（6/20，30%）、SCLC（23/50，46%），在非小細胞肺癌中高表達率明顯高于其他組織學(xué)類型。同時分析出MCM7過度表達可以促進腫瘤生長、轉(zhuǎn)移，并導(dǎo)致患者生存時間縮短。還表明MCM7表達與病理分級、TNM分期相關(guān)。

表2 MCM7與RACK1在各類型肺癌中表達與臨床病理因素間關(guān)系Tab. 2 Relationship between expression of MCM7 and RACK1 in various types of lung cancer and clinicopathological factors

圖4 Kaplan-Meier法分析MCM7表達與各類型肺癌患者生存時間的關(guān)系（P=0.006，Log-rank檢驗）Fig. 4 Kaplan-Meier analysis of the relationship between MCM7 expression and survival time of various types of lung cancer patients (P=0.006,Log-rank test)

圖5 Kaplan-Meier法分析RACK1與各類型肺癌患者生存時間（P=0.002，Log-rank檢驗）Fig. 5 Kaplan-Meier analysis of the relationship between RACK1 expression and survival time of patients with various types of lung cancer(P=0.002, Log-rank test)

表3 肺癌組織中MCM7與RACK1蛋白表達的相關(guān)性(Pearson相關(guān)分析)Tab.3 Correlation between MCM7 and RACK1 protein expression in lung cancer tissue microarrays (Pearson correlation analysis)

最近，研究人員發(fā)現(xiàn)RACK1在許多腫瘤如鼻咽癌、結(jié)腸直腸癌、肺腺癌，肝細胞癌、食管鱗狀細胞癌中高表達。關(guān)于其在腫瘤發(fā)生中的作用，RACK1主要參與腫瘤生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[14-18]。然而，其致癌性質(zhì)存在一些相互矛盾的結(jié)果；該蛋白可以對Src活性產(chǎn)生陰性對照，并對Ki-Ras介導(dǎo)的形態(tài)學(xué)細胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)生抑制作用[19]。據(jù)報道，它在胃癌中是下調(diào)的，作為負調(diào)節(jié)Wnt信號的腫瘤抑制劑[20]。有研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)研究了184例肺癌和配對的正常肺組織，RACK1表達在腺癌中顯著增高且頻繁，但在肺鱗狀細胞癌和大細胞癌中幾乎檢測不到。此外，RACK1的表達也與腺癌患者的病理分期、腫瘤大小和淋巴結(jié)狀態(tài)顯著相關(guān)[21]。而本研究結(jié)果顯示RACK1在各種組織學(xué)類型肺癌中均有表達，RACK1高表達率在各類型肺癌中分別為SCC（123/150，82.0%）、ADC（130/150，86.7%）、LCLC（8/20，35%）、SCLC（5/50，10%）；在鱗癌、腺癌中高表達率均明顯高于其他組織類型。RACK1表達水平與肺癌的病理分級、組織分類、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。在III期、IV期肺癌組織中的表達高于I期、II期肺癌，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌中高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者。高表達者生存時間短。

我們的前期研究[4]發(fā)現(xiàn) RACK1是MCM7 結(jié)合蛋白之一，并證明RACK1通過MCM7/RACK1 /Akt信號復(fù)合物介導(dǎo)MCM7磷酸化，從而調(diào)控人類非小細胞肺癌細胞生長和細胞周期進程。 RACK1作為中央腳手架，將Akt與MCM7接近。RACK1的過度表達增加Akt和MCM7之間的相互作用并促進Akt依賴性MCM7磷酸化，這進而增加MCM7與染色質(zhì)和MCM復(fù)合物形成的結(jié)合。這些變化一起促進DNA復(fù)制和細胞增殖。研究結(jié)果揭示了調(diào)節(jié)非小細胞肺癌生長的新信號通路[22]。而本研究結(jié)果顯示，MCM7與RACK1不僅在非小細胞肺癌中高表達，在某些小細胞肺癌中也存在高表達現(xiàn)象。 那么，二者在小細胞肺癌中是否也存在調(diào)控關(guān)系，尚需進一步研究。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)并證實了RACK1與MCM7在非小細胞肺癌和小細胞肺癌中均存在高表達現(xiàn)象，且二者表達具有正相關(guān)性，MCM7與RACK1聯(lián)合檢測有可能成為各類型肺癌細胞增殖、預(yù)測肺癌預(yù)后和臨床靶向治療的生物學(xué)新指標(biāo)。