賀紅柳， 崔美英， 王 豐， 馮曄子， 袁 磊

(1鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科， 河南 鄭州 450052； 2鄭州市第七人民醫(yī)院心血管內(nèi)科， 河南 鄭州 450000； 3漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校漯河市醫(yī)學(xué)生物工程重點實驗室， 河南 漯河 462002)

大腸癌即結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是威脅我國居民健康的主要惡性腫瘤之一。二十年前，中國大腸癌的發(fā)病率和死亡率均低于世界平均水平，但近年來其發(fā)病率逐年攀升，目前穩(wěn)居惡性腫瘤發(fā)病譜第3位，其死亡率也高居腫瘤死亡原因第5位[1-2]。由于我國大腸癌早期篩查工作還未能廣泛開展，大部分大腸癌患者在確診時已屬于中晚期[3]。目前對晚期大腸癌主要采用以化療為主的綜合治療方案，但多藥耐藥性的產(chǎn)生是導(dǎo)致大腸癌化療失敗的主要原因之一[4]。因此如何逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性以改善大腸癌患者的預(yù)后仍是目前亟待解決的問題?；罨腎KK/p65信號通路可通過上調(diào)多藥耐藥蛋白1(multidrug resistance protein 1，MDR1)、多藥耐藥相關(guān)蛋白1/2/3(multidrug resistance-associated protein 1/2/3，MRP1/2/3)和ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體G2(ATP-binding cassette transporter G2，ABCG2)等導(dǎo)致大腸癌產(chǎn)生多藥耐藥性[5-7]。透明質(zhì)酸蛋白聚糖連結(jié)蛋白1(hyaluronan and proteoglycan link protein 1，HAPLN1)，是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，穩(wěn)定蛋白聚糖與透明質(zhì)酸的結(jié)合，有易于透明質(zhì)酸激活其受體，如Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)、CD44和透明質(zhì)酸介導(dǎo)運(yùn)動的受體(receptor for hyaluronan-mediated motility，RHAMM)等[8-9]。Mebarki等[10]研究發(fā)現(xiàn)，HAPLN1是影響肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素，并在維持肝癌細(xì)胞的干細(xì)胞特性中發(fā)揮著重要作用。Huynh等[11]證實，HAPLN1是導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤產(chǎn)生硼替佐米耐藥的關(guān)鍵分子。但關(guān)于HAPLN1在大腸癌多藥耐藥產(chǎn)生中的作用目前尚不明確。因此，本研究通過構(gòu)建人大腸癌甲氨蝶呤(methotrexate，MTX)耐藥細(xì)胞株HT-29/MTX，觀察HAPLN1表達(dá)的變化及其對HT-29/MTX細(xì)胞MTX耐藥性的影響，并探究其可能的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

人大腸癌HT-29細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone；MTX購自中國食品藥品檢定研究院；嘌呤霉素(puromycin，Puro)和IκB激酶(IκB kinase，IKK)抑制劑IKK16購自Sigma；人HAPLN1干擾質(zhì)粒pRS-HAPLN1、人MRP2干擾質(zhì)粒pRS-MRP2和無義對照質(zhì)粒 pRS-scrambled 購自O(shè)rigene；CCK-8試劑盒、TRIzol試劑、RIPA裂解液和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；RT-PCR試劑盒購自大連寶生物公司；PCR引物由大連寶生物公司合成；兔抗人HAPLN1、MRP2、IKKα/β、p-IKKα/β(Ser176/Ser177)、p65、p-p65(Ser536)和β-actin單克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自Abcam。

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人大腸癌HT-29細(xì)胞用含10 % FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5 % CO2條件下中進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)到80%以上時，按1 ∶3的比例傳代。

2.2建立耐藥細(xì)胞株HT-29/MTX 取對數(shù)生長期HT-29細(xì)胞，用0.01 μmol/L MTX處理48 h后，更換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞覆蓋率再次達(dá)到80%時，重復(fù)以上處理，當(dāng)HT-29細(xì)胞在該藥物濃度下能穩(wěn)定生長傳代時，將MTX提高至下一濃度。MTX的濃度梯度為0.01 μmol/L、0.02 μmol/L、0.05 μmol/L、0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.5 μmol/L和1 μmol/L，整個誘導(dǎo)過程歷時7個月，最終得到耐藥細(xì)胞株HT-29/MTX。HT-29/MTX細(xì)胞用含有1 μmol/L MTX的培養(yǎng)液培養(yǎng)以維持耐藥性。停用MTX 2周后，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.3構(gòu)建穩(wěn)定干擾HAPLN1和MRP2的細(xì)胞株 取對數(shù)生長期的HT-29/MTX細(xì)胞，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?2000將質(zhì)粒pRS-HAPLN1、pRS-MRP2和pRS-scrambled分別轉(zhuǎn)染HT-29/MTX細(xì)胞；轉(zhuǎn)染48 h后，用含0.5 mg/L Puro的培養(yǎng)液進(jìn)行篩選，2周后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別命名為shHAPLN1、shMRP2和shControl。

2.4RT-PCR檢測mRNA水平 用TRIzol試劑提取總RNA，取2 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄條件為42 ℃ 60 min、70 ℃ 15 min。取2 μL上述反應(yīng)液進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 1 min; 94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，32個循環(huán)。引物采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計，并經(jīng)BLAST驗證。HAPLN1(211 bp)的上游引物序列為5’-ACTGTTGTGGTAGCACTGGA-3’，下游引物序列為5’-TGGGATATTGCACAGAGCCA-3’；MRP2(206 bp)的上游引物序列為5’-GCAGACCTGCCACTTTGTTT-3’，下游引物序列為5’-TCTGTGAGTACAAGGGCCAG-3’；GAPDH(207 bp)的上游引物序列為5’-AATTCCATGGCACCGTCAAG-3’，下游引物序列為5’-GGGCAGAGATGATGACCCTT-3’。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下拍照，用ImageJ 1.45s軟件進(jìn)行灰度分析，以目的產(chǎn)物與內(nèi)參照GAPDH的灰度值比值表示目的基因mRNA的相對表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

2.5CCK-8法檢測細(xì)胞活力 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔5 000個接種于96孔板，培養(yǎng)24 h。去上清，加入100 μL含有不同濃度MTX的培養(yǎng)液。對于非耐藥細(xì)胞株，MTX的終濃度分別為0.01 μmo/L、0.02 μmol/L、0.03 μmol/L、0.04 μmol/L、0.05 μmol/L和0.06 μmol/L；對于耐藥細(xì)胞株，MTX的終濃度分別為2 μmol/L、4 μmol/L、8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L和64 μmol/L。每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，同時設(shè)對照孔和調(diào)零孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm波長吸光度(A)值。實驗重復(fù)3次。細(xì)胞活力抑制率(%)=(1-加藥孔A值/對照孔A值)×100%。使用SPSS 16.0軟件的Probit回歸模型計算半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)，并計算出耐藥倍數(shù)與逆轉(zhuǎn)倍數(shù)。耐藥倍數(shù)=耐藥細(xì)胞IC50/敏感細(xì)胞IC50，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=耐藥細(xì)胞IC50/逆轉(zhuǎn)細(xì)胞IC50。

2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 分別取shControl組、shHAPLN1組和shMRP2組細(xì)胞，加入MTX(終濃度為4 μmol/L)。培養(yǎng)48 h后，收集各組細(xì)胞，PBS洗滌2次，用200 μL結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻；加入10 μL PI染色液，輕輕混勻；室溫避光孵育15 min后，用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD)檢測各試驗樣本的細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3次。

2.7Western blot法檢測蛋白水平 取shControl組和shHAPLN1組細(xì)胞，并向shControl組細(xì)胞加入IKK16(終濃度為10 μmol/L)。培養(yǎng)48 h后，用RIPA裂解各組細(xì)胞提取總蛋白，用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度；取25 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE并轉(zhuǎn)移至PVDF膜；用脫脂奶粉封閉1 h，加入抗HAPLN1、p-IKKα/β、IKKα/β、p-p65、p65、MRP2和β-actin抗體(1 ∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜；TBST洗膜3次，加入II抗(1 ∶2 000稀釋)室溫下孵育1 h；TBST洗膜3次，加入ECL進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，暗室X膠片顯影，拍照。使用ImageJ 1.45s軟件進(jìn)行灰度分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參照β-actin的灰度比值作為目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0分析數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用SNK法進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTX耐藥前后HAPLN1和MRP2表達(dá)的變化

Western blot結(jié)果顯示，與親代HT-29細(xì)胞相比，耐藥細(xì)胞株HT-29/MTX中HAPLN1和MRP2蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖1；RT-PCR結(jié)果也同樣表明，HT-29/MTX細(xì)胞中HAPLN1和MRP2的mRNA表達(dá)水平顯著高于HT-29細(xì)胞(P<0.05)，見圖2。這提示HT-29細(xì)胞MTX耐藥性的產(chǎn)生可能與HAPLN1和MRP2高表達(dá)有關(guān)。

2 RNA干擾對HAPLN1和MRP2 mRNA表達(dá)水平的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，與shControl組相比，shHAPLN1組中HAPLN1和MRP2的mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)，而shMRP2組僅MRP2的mRNA表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)，見圖3。這表明特異性shRNA可抑制HT-29/MTX細(xì)胞中HAPLN1和MRP2基因表達(dá)，此外HAPLN1還可調(diào)控MRP2基因的表達(dá)。

Figure 1.The protein levels of HAPLN1 and MRP2 before and after MTX resistance in the HT-29 cells were determined by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHT-29 group.

圖1MTX耐藥前后HT-29細(xì)胞中HAPLN1和MRP2蛋白表達(dá)水平的變化

Figure 2.The mRNA levels of HAPLN1 and MRP2 before and after MTX resistance in the HT-29 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHT-29 group.

圖2MTX耐藥前后HT-29細(xì)胞中HAPLN1和MRP2mRNA表達(dá)水平的變化

Figure 3.The mRNA expression of HAPLN1 and MRP2 before and after silencing ofHAPLN1 gene orMRP2 gene in the HT-29/MTX cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsshControl group.

圖3沉默HAPLN1或MRP2基因前后HT-29/MTX細(xì)胞中HAPLN1和MRP2mRNA表達(dá)水平的變化

3 沉默HAPLN1和MRP2基因?qū)TX毒性作用的影響

CCK-8實驗結(jié)果顯示，與0 μmol/L組相比，0.02～0.06 μmol/L MTX組的HT-29細(xì)胞活力均明顯降低(P<0.05)，HT-29/MTX細(xì)胞和shControl細(xì)胞的活力從4 μmol/L MTX組開始顯著降低(P<0.05)，2～64 μmol/L MTX組的shHAPLN1細(xì)胞和shMRP2細(xì)胞的活力都明顯下降(P<0.05)；MTX作用HT-29細(xì)胞、HT-29/MTX細(xì)胞、shControl細(xì)胞、shHAPLN1細(xì)胞和shMRP2細(xì)胞48 h的IC50分別為0.033 μmol/L、15.304 μmol/L、15.182 μmol/L、6.119 μmol/L和7.801 μmol/L； HT-29/MTX細(xì)胞、shControl細(xì)胞、shHAPLN1細(xì)胞和shMRP2細(xì)胞的耐藥倍數(shù)分別為463.756、460.061、185.424和236.394；shHAPLN1細(xì)胞和shMRP2細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為2.501和1.962。這表明沉默HAPLN1和MRP2基因可提高耐藥株HT-29/MTX細(xì)胞對MTX的敏感性，見圖4。

4 沉默HAPLN1和MRP2基因?qū)TX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與shControl組相比，shHAPLN1組和MRP2組細(xì)胞凋亡率的差異無統(tǒng)統(tǒng)計學(xué)顯著性，而shControl+MTX組、shHAPLN1+MTX組和shMRP2+MTX組的細(xì)胞凋亡率均顯著升高(P<0.05)；同時，shHAPLN1+MTX組和shMRP2+MTX組的細(xì)胞凋亡率均明顯高于shControl+MTX組(P<0.05)。這表明抑制HAPLN1或MRP2基因表達(dá)并不影響HT-29/MTX細(xì)胞凋亡，但可增強(qiáng)MTX誘導(dǎo)的HT-29/MTX細(xì)胞凋亡，見圖5。

Figure 4.The effect of MTX at different concentrations on the cell viability in each group. A: HT-29 cells; B: HT-29/MTX cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 μmol/L group.

圖4不同濃度MTX對各組細(xì)胞活力的影響

5 沉默HAPLN1基因?qū)KKα/β和p65蛋白磷酸化水平以及MRP2蛋白表達(dá)水平的影響

Western blot實驗結(jié)果顯示，與shControl組相比，shHAPLN1組和shControl+IKK16組細(xì)胞中的p65和IKKα/β蛋白磷酸化水平以及MRP2的蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；此外，shHAPLN1組細(xì)胞的HAPLN1蛋白表達(dá)水平明顯低于shControl組(P<0.05)，但shControl組與shControl+IKK16組在HAPLN1蛋白表達(dá)水平上的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性。這提示IKK/p65信號通路可能參與了HAPLN1對MRP2表達(dá)的調(diào)控，見圖6。

討 論

HAPLN1是一種分子量約為45 kD的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，由1段信號肽、1個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域和2個蛋白聚糖串聯(lián)重復(fù)(proteoglycan tandem repeat，PTR)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。HAPLN1可穩(wěn)定透明質(zhì)酸與腫瘤細(xì)胞表面受體的結(jié)合，繼而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移以及腫瘤血管生成[12-15]。HAPLN1在未分化的HepaRG祖細(xì)胞中呈高表達(dá)，但在已分化的肝細(xì)胞樣的HepaRG細(xì)胞中幾乎檢測不到，沉默HAPLN1基因可下調(diào)HepaRG祖細(xì)胞中Snail、Acta2、Col4a1和Lgr5等間葉細(xì)胞或干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)；同時，在HAPLN1高表達(dá)的肝癌病理組織中干細(xì)胞標(biāo)志物PROM1也呈高表達(dá)[10]。這表明HAPLN1可能在維持腫瘤干細(xì)胞特性方面發(fā)揮著重要作用。由此推測，HAPLN1可能與腫瘤細(xì)胞耐藥性的發(fā)生有關(guān)。

Figure 5.Silencing ofHAPLN1 gene orMRP2 gene enhanced MTX-induced apoptosis in the HT-29/MTX cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsshControl group;#P<0.05vsshControl+MTX group.

圖5沉默HAPLN1或MRP2基因增強(qiáng)MTX誘導(dǎo)的HT-29/MTX細(xì)胞凋亡

Figure 6.Silencing ofHAPLN1 gene inhibited the phosphorylation of IKKα/β and p65 and down-regulated the protein expression of MRP2 in the HT-29/MTX cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsshControl group.

圖6沉默HAPLN1基因抑制IKKα/β和p65蛋白磷酸化以及MRP2蛋白表達(dá)

MRP2過表達(dá)是導(dǎo)致大腸癌細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性的重要機(jī)制之一[16]。MRP2屬ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC transporter)家族成員，也被稱為ABCC2。MRP2通過水解ATP獲取能量，將腫瘤細(xì)胞內(nèi)的多種化療藥物(如MTX)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，降低腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性[17]。臨床研究也證實，MRP2與MTX在急性淋巴細(xì)胞白血病患者體內(nèi)的分布和清除密切相關(guān)[18-20]。

本研究結(jié)果顯示，在人大腸癌耐藥細(xì)胞株HT-29/MTX中HAPLN1和MRP2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于其親代HT-29細(xì)胞，耐藥倍數(shù)高達(dá)463.756倍。采用shRNA干擾技術(shù)沉默HAPLN1或MRP2基因后，MTX對HT-29/MTX細(xì)胞的IC50從15.304 μmol/L分別降至6.119 μmol/L和7.801 μmol/L，逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為2.501倍和1.962倍。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果也證實，抑制HAPLN1和MRP2基因均可增強(qiáng)MTX誘導(dǎo)的HT-29/MTX細(xì)胞凋亡。這些研究結(jié)果表明，下調(diào)HAPLN1或MRP2基因表達(dá)可逆轉(zhuǎn)HT-29/MTX細(xì)胞對MTX的耐藥性。

Ke等[21]研究發(fā)現(xiàn)，激活NF-κB信號通路可通過上調(diào)MRP2蛋白表達(dá)降低人小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞對喜樹堿和順鉑的敏感性。Zhang[22]也發(fā)現(xiàn)，高氨血癥可增強(qiáng)血腦屏障中MRP2和ABCB1的表達(dá)，NF-κB信號通路介導(dǎo)了該作用。已有學(xué)者研究證實，NF-κB可直接與MRP2基因的啟動子結(jié)合從而調(diào)控其表達(dá)[23]。這表明MRP2可能是受NF-κB信號通路調(diào)控的下游靶基因。而Huynh等[11]研究發(fā)現(xiàn)，HAPLN1可通過其PTR結(jié)構(gòu)域，以不依賴透明質(zhì)酸受體的方式激活NF-κB信號通路，誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞產(chǎn)生硼替佐米耐藥性。

NF-κB蛋白家族由5種轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成：p50、p52、p65(RelA)、c-Rel和RelB，各成員之間可兩兩組合形成同型或異型二聚體，即NF-κB，在哺乳動物細(xì)胞中最常見的NF-κB是由p65和p50形成的異型二聚體。細(xì)胞質(zhì)中的NF-κB通常與抑制蛋白IκB形成復(fù)合體而以無活性狀態(tài)存在。IKK由2個催化亞基(IKKα和IKKβ)和1個調(diào)節(jié)亞基(IKKγ)組成的三聚體，活化的IKK可磷酸化IκB而使其降解，同時也可磷酸化p65而促進(jìn)其移位入核，以調(diào)控靶基因的表達(dá)[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲減HAPLN1基因表達(dá)可下調(diào)HT-29/MTX細(xì)胞中IKKα/β和p65蛋白磷酸化水平，從而抑制了IKK/p65信號通路活化，同時還下調(diào)了MRP2的mRNA和蛋白表達(dá)水平；而IKKα/β抑制劑IKK16在阻斷IKK/p65信號通路的同時也可下調(diào)MRP2蛋白表達(dá)水平。由此可見，HAPLN1可能是通過活化NF-κB信號通路以上調(diào)MRP2基因表達(dá)的，這可能是其降低HT-29/MTX對MTX敏感性的重要機(jī)制之一。

綜上所述，敲減HAPLN1基因表達(dá)可在體外增強(qiáng)人大腸癌耐藥細(xì)胞株HT-29/MTX對MTX的敏感性，這可能與其抑制IKK/p65信號通路活化，繼而下調(diào)MRP2基因表達(dá)有關(guān)，具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。