喬付杰 李俊樂 高 惠 滕麗微，2 王繼飛 劉振生，2*

(1.東北林業(yè)大學(xué)野生動物資源學(xué)院，哈爾濱，150040；2.國家林業(yè)和草原局野生動物保護(hù)學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱，150040；3.寧夏賀蘭山國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，銀川，750021)

阿拉善馬鹿(Cervuselaphusalxaicus)是馬鹿(C.elaphus)的一個(gè)亞種，為國家Ⅱ級重點(diǎn)保護(hù)野生動物[1]。馬鹿屬偶蹄目(Artiodactyla)鹿科(Ceridae)鹿亞科(Cervinae)，我國分布有8個(gè)馬鹿亞種，分別為天山亞種(C.e.songaricus)、塔里木亞種(C.e.yarkandensis)、阿爾泰亞種(C.e.sibiricus)、甘肅亞種(C.e.kansuensis)、阿拉善亞種(C.e.alxaicus)、四川亞種(C.e.macneilli)、西藏亞種(C.e.wallichi)和東北亞種(C.e.xanthopygus)[2]。阿拉善馬鹿目前僅分布于寧夏和內(nèi)蒙古交界的賀蘭山中段，是我國唯一幸存的該亞種的有效種群[2-4]，劉振生等[5-6]和駱穎等[7]已對賀蘭山地區(qū)阿拉善馬鹿的生境選擇進(jìn)行了較為詳細(xì)的研究，高惠等就該地區(qū)阿拉善馬鹿的生境適宜性做了評價(jià)[8]。但目前關(guān)于野生阿拉善馬鹿的分子研究尚屬空白。

線粒體DNA是母系遺傳，具有分子量小，進(jìn)化速度快等特點(diǎn)。其Cytb區(qū)基因的進(jìn)化速度適中，一個(gè)較小的基因片段就包含著從種內(nèi)到種間的遺傳進(jìn)化信息[9]，對種群遺傳多樣性有很重要的作用。本文對采自賀蘭山的野生阿拉善馬鹿糞便樣本進(jìn)行DNA提取、線粒體Cytb區(qū)DNA序列測定和分析，分析該物種的遺傳變異和其他中國分布的馬鹿亞種的遺傳分化，為其遺傳多樣性保護(hù)提供科學(xué)依據(jù)，對該物種的合理管護(hù)、促進(jìn)種群發(fā)展具有重要意義。

1 研究地概況

賀蘭山位于寧夏回族自治區(qū)和內(nèi)蒙古自治區(qū)交界處(38°21′—39°22′ N，105°49′—106°42′ E)，由內(nèi)蒙古賀蘭山國家級自然保護(hù)區(qū)和寧夏賀蘭山國家級自然保護(hù)區(qū)組成。海拔一般為2 000—3 000 m，為典型的大陸性氣候，植被依據(jù)海拔的上升呈明顯的垂直分異，自下而上依次為山地草原帶(1 400—1 600 m)，山地疏林草原帶(1 600—2 000 m)，山地針葉林帶(1 900—3 000 m)，亞高山灌叢和草甸帶(3 000—3 556 m)[10]。

2 材料與方法

2.1 樣品采集與DNA提取

在2016年8—9月和2017年2—3月在賀蘭山地區(qū)采集馬鹿野生群體的新鮮糞便樣本396份(圖1)。采集時(shí)使用一次性PE手套，防止交叉污染，并用手持GPS定位。采集的糞便倒入無水乙醇保存，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后冷凍保存。使用QIAGEN QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit 試劑盒提取DNA，具體實(shí)驗(yàn)方法見試劑盒詳細(xì)使用說明書，將提取好的DNA分成兩份，一份放置于-20℃用于下一步的擴(kuò)增使用，一份放置于-80℃凍存。

圖1 研究區(qū)域與采樣點(diǎn)Fig.1 Study area and sampling points

2.2 物種鑒定

PCR擴(kuò)增線粒體Cytb區(qū)全序列。引物為上游：5′-GAAAAACCATCGTTGTCATTCA-3′；下游5′-GGAGGTTGGTAGCTCTCCTTTT-3′[11]，擴(kuò)增片段大小約1 200 bp。PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系為25 μL，按順序分別將2×PCR buffer for KOD FX Neo 12.5 μL，2 Mm dNTPs 5 μL，10 pmol/μL上游引物 0.75 μL，10 pmol/μL下游引物0.75 μL，PCR grade water 3.5 μL，模板DNA 1.5 μL，KOD FX NEO(1.0 OU/L)1 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，55℃退火30 s，68℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后在68℃再延伸7 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工生物公司純化并雙向測序，測序引物為擴(kuò)增引物。

2.3 個(gè)體識別

經(jīng)物種識別確定后的馬鹿糞便樣品使用多態(tài)性較高的9對微衛(wèi)星引物CSSM19、BM1818、T501、BM3628、T530、RT1、DM45、HAUT14、T156[12-16]進(jìn)行基因分型分析，共篩選得到糞便DNA質(zhì)量較高的297份樣本，識別出278個(gè)阿拉善馬鹿個(gè)體，并用于后續(xù)的種群遺傳多樣性研究。

2.4 數(shù)據(jù)分析

利用Bioedit 7.0.5.3[17]對測得的序列進(jìn)行排列對比并輔以人工校對，用DNASP 5.00.07[18]計(jì)算核苷酸多樣性(Nucleotide diversity，π)和單倍型多樣性(Haplotype diversity，h)，以對馬鹿種群的遺傳多樣性進(jìn)行評估，用MEGA 7.0.26[19-21]和MrBayes v3.2.6[22]以梅花鹿(C.nippon)序列(登錄號：AB211429)作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用Network 5.00.3[23]以 Median-joining 法構(gòu)建各單倍型之間網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，并對圖中各個(gè)單倍型進(jìn)行群體對應(yīng)關(guān)系分析。

3 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)成功擴(kuò)增出107個(gè)阿拉善馬鹿Cytb區(qū)基因全序列，序列長1 075 bp，堿基T的平均含量為29.38%，堿基C的平均含量為26.69%，堿基A的平均含量為30.31%，堿基G的平均含量為13.62%，A+T的平均含量為59.68%，顯著高于C+G的平均含量40.32%。因此阿拉善馬鹿線粒體Cytb區(qū)富含堿基A和T并反G偏歧。說明堿基含量具有一定的偏歧性，符合哺乳動物堿基組成比例。

在獲得的1 075 bp全序列中，保守位點(diǎn)有1 065個(gè)，變異位點(diǎn)有10個(gè)，均為堿基置換無插入缺失，其中單突變位點(diǎn)7個(gè)，簡約變異位點(diǎn)3個(gè)，占分析位點(diǎn)的0.93%。單突變位點(diǎn)5、15、47、174、253、389、1 038，保守位點(diǎn)11、1 039、1 040。共定義了10個(gè)單倍型，其中有93個(gè)個(gè)體共享1個(gè)單倍型，6個(gè)個(gè)體共享1個(gè)單倍型，其他單倍型均為獨(dú)有的。單倍型多樣性(h=0.243)，核苷酸多樣性(π=0.000 32)。中性檢驗(yàn)得到Tajima’sD值為-2.073 91(P<0.005)，F(xiàn)u and Li’sD值為-3.610 35(P<0.02)。

基于本研究的序列數(shù)據(jù)(Hap_1—Hap_10)與從 GenBank 中檢索獲得的 15條近緣馬鹿群體(Hap_11—Hap_24)的線粒體CytbDNA全序列，采用鄰接(NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(Kimura 2-parameter model)通過1 000次的自舉檢驗(yàn)估計(jì)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系樹構(gòu)建中節(jié)點(diǎn)(圖2)，用Modeltest 3.7分析得到最佳模型HKY+I(-lnL=2 007.419 2，AIC=4 024.838 4)，馬爾科夫鏈的蒙特卡洛法(MCMC)運(yùn)行100萬代，取樣頻率為100代，丟棄25%老化值(burnin samples)(圖3)。登錄號：東北馬鹿：AB021097(共享Hap_1)、AF423197(Hap_11)、GU457434(Hap_12)、JF893493(Hap_13)、KM410148(Hap_14)、JF893494(Hap_15)；天山馬鹿：HQ191429(Hap_16)、KJ025072(Hap_17)、KF781108(Hap_18)、KF781115(Hap_19)、KF781114(Hap_20)；西藏馬鹿：AY044861(Hap_21)；四川馬鹿：AY035875(Hap_22)；甘肅馬鹿：AY070223(Hap_23)、AB021098(Hap_24)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這24個(gè)單倍型分為明顯的2支，阿拉善馬鹿線粒體CytbDNA單倍型聚為一個(gè)單系，與東北馬鹿親緣關(guān)系較近。依據(jù) Network 軟件以中接法(Median-joining)構(gòu)建的單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖顯示(圖 4)，Hap_1—Hap_10大部分單倍型之間經(jīng)過一步突變，Hap_1做為阿拉善馬鹿祖先單倍型。單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)一步支持了系統(tǒng)發(fā)育樹的分析，阿拉善馬鹿10個(gè)單倍型與其他引用的單倍型明顯分離形成兩個(gè)類群。

圖2 使用鄰接法構(gòu)建的24個(gè)單倍型的系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.2 Neighbor-joining phylogenetic tree constructed from the 24 Cyt b haplotypes

圖3 基于線粒體Cyt b區(qū)單倍型構(gòu)建的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 MrBayes phylogenetic tree constructed from the 24 Cyt b haplotypes

圖4 24個(gè)單倍型的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系Fig.4 Network relationship of the 24 haplotypes

4 討論

本次研究采集的樣品為非損傷取樣方法采集，使用糞便樣本提取的DNA數(shù)量有限且質(zhì)量較差，線粒體標(biāo)記可能出現(xiàn)擴(kuò)增錯(cuò)誤等問題。在采樣過程中盡可能采集新鮮糞便以保證提取的DNA質(zhì)量，在實(shí)驗(yàn)過程中通過雙向測序和重復(fù)測序的方法，讓每個(gè)DNA樣品至少通過兩次獨(dú)立的擴(kuò)增、測序來保證其測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

遺傳多樣性是評估種群在野外長期生存能力的重要指標(biāo)，也是制定物種保護(hù)計(jì)劃所必需的內(nèi)容之一。衡量一個(gè)種群線粒體DNA多樣性有兩個(gè)指標(biāo)：單倍型多樣度值(h)和核苷酸多樣度值(π)。h值和π值越大，群體的多態(tài)性程度越高，遺傳多樣性也越豐富。通過與其他馬鹿亞種線粒體Cytb區(qū)DNA的研究相比較，發(fā)現(xiàn)阿拉善馬鹿的h值和π值都較低(表1)。表明阿拉善馬鹿的遺傳多樣性較低，分析原因可能是賀蘭山周圍被城市、沙漠、河流(黃河)隔斷形成孤島的地理特征所影響，易發(fā)生近親繁殖，缺少有效的基因交流，從而導(dǎo)致阿拉善馬鹿種群的遺傳多樣性降低。

在本研究的10個(gè)突變位點(diǎn)中無堿基插入和缺失，說明該物種的線粒體CytbDNA突變是近期發(fā)生的[26]。且在系統(tǒng)發(fā)生樹中明顯看到阿拉善馬鹿聚為一個(gè)單系，這與同域分布的賀蘭山巖羊在中國不同地理種群的系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果相似[27]。中性檢驗(yàn)除Fu’sFs為顯著負(fù)值外，都為不顯著的負(fù)值，表示群體可能經(jīng)歷過種群擴(kuò)張。從系統(tǒng)發(fā)生樹與單倍型的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖中發(fā)現(xiàn)阿拉善馬鹿與東北馬鹿親緣關(guān)系較近，與甘肅馬鹿、四川馬鹿、西藏馬鹿親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表1 多個(gè)馬鹿亞種的遺傳多樣性參數(shù)比較

Tab.1 Comparison of genetic diversity parameter of muti-subspecies of red deer

本研究證明了阿拉善馬鹿遺傳多樣性較低，且與東北馬鹿親緣關(guān)系較近，與中國分布的其他馬鹿亞種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在本研究的系統(tǒng)發(fā)育樹中(圖2，圖3)看到中國分布的這6個(gè)馬鹿亞種先分化成兩支，后分化出東北馬鹿、甘肅馬鹿、四川馬鹿、西藏馬鹿和阿拉善馬鹿(圖2)。進(jìn)一步證明了中國馬鹿是從中東和歐洲返回大陸的過程中是從西向東逐漸分化的[4]，這為中國馬鹿的分子系統(tǒng)進(jìn)化和大陸遷移史研究提供了科學(xué)依據(jù)。

致謝：感謝寧夏賀蘭山國家級自然保護(hù)區(qū)和內(nèi)蒙古賀蘭山國家級自然保護(hù)區(qū)的工作人員在樣品采集過程中給予的幫助。