王惠貞，武榮盛，藺汝罡，韓 雪

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CO2濃度增高對水稻籽粒淀粉代謝相關(guān)酶活性的影響*

王惠貞1，武榮盛1，藺汝罡2，韓 雪3

（1．內(nèi)蒙古生態(tài)與農(nóng)業(yè)氣象中心，呼和浩特 010051；2．內(nèi)蒙古自治區(qū)氣象局，呼和浩特 010051；3．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所，北京 100081）

以高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)粳稻松粳9號和稻花香2號為材料，利用開放式空氣CO2濃度富集系統(tǒng)（FACE）實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，研究CO2濃度增高對水稻籽粒淀粉代謝相關(guān)酶活性的影響。試驗(yàn)設(shè)正常大氣CO2濃度（400±40μmol·mol?1）和高CO2濃度（600±60μmol·mol?1），測定開花后兩個(gè)水稻品種籽粒中ADPG焦磷酸化酶、淀粉合成酶和淀粉分支酶活性的變化。結(jié)果表明，CO2濃度增高對不同灌漿進(jìn)程中酶活性的影響程度有顯著差異，對乳熟期之后ADPG焦磷酸化酶、可溶性和顆粒型淀粉合成酶活性的表達(dá)均有較明顯的促進(jìn)作用，僅阻礙了乳熟期籽粒中淀粉分支酶活性的表達(dá)；淀粉代謝相關(guān)酶活性對CO2濃度增高的響應(yīng)因品種而異，松粳9號籽粒中ADPG焦磷酸化酶活性受CO2濃度增高的影響較大，而稻花香2號淀粉合成酶活性受其影響更大。說明隨著灌漿進(jìn)程的推進(jìn)，CO2濃度增高對淀粉生物合成途徑中關(guān)鍵酶活性表達(dá)的影響程度存在明顯的時(shí)段特征，且不同品種的響應(yīng)程度有顯著差異，總體來看，CO2濃度增高可在一定程度上促進(jìn)淀粉代謝相關(guān)酶活性的表達(dá)。

CO2濃度；FACE系統(tǒng)；水稻；ADPG焦磷酸化酶；淀粉合成酶；淀粉分支酶

大氣CO2濃度增高對作物影響已成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)問題之一[1]。根據(jù)世界氣象組織（WMO）的年度報(bào)告，至2012年底全球大氣CO2濃度比工業(yè)革命前的280μmol·mol?1增加了約42.86%，預(yù)計(jì)到21世紀(jì)中期將達(dá)550μmol·mol?1，21世紀(jì)末將增至936μmol·mol?1[2?4]。水稻是世界最重要的三大糧食作物之一，中國水稻的種植面積為3000萬hm2左右，居世界第二[5]。大氣CO2濃度變化必然影響水稻的生長發(fā)育和生理過程[6?8]，水稻籽粒胚乳中淀粉代謝相關(guān)酶是影響水稻品質(zhì)的關(guān)鍵因素，因此，研究CO2濃度增高對淀粉代謝相關(guān)酶活性的影響對于未來優(yōu)質(zhì)水稻栽培和品種選育具有重要意義。

淀粉的生物合成是由一系列酶調(diào)控的反應(yīng)過程[9?11]。關(guān)于水稻籽粒灌漿過程中有關(guān)酶活性與淀粉積累關(guān)系的研究認(rèn)為，ADPG焦磷酸化酶、淀粉合成酶和淀粉分支酶對控制淀粉合成與積累作用較大[12?13]，其中ADPG焦磷酸化酶和顆粒結(jié)合型淀粉合成酶催化直鏈淀粉的合成[14?15]，ADP葡萄糖焦磷酸化酶、可溶性淀粉合成酶和淀粉分支酶催化支鏈淀粉的合成[9,16?17]。關(guān)于溫度、光照、水分脅迫對上述酶活性變化影響等方面國內(nèi)外已有很多研究[18?22]，但CO2濃度增高對水稻籽粒中淀粉代謝相關(guān)酶活性影響方面的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究旨在采用更接近于自然環(huán)境的開放式空氣CO2濃度富集（FACE）系統(tǒng)對水稻籽粒淀粉代謝相關(guān)酶活性變化進(jìn)行探討，深入研究CO2增高對水稻淀粉代謝相關(guān)酶活性的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況與土壤類型

FACE實(shí)驗(yàn)平臺(tái)位于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院昌平實(shí)驗(yàn)基地（40°08′N，116°08′E），土壤類型屬褐潮土，土壤含有機(jī)質(zhì)18.27g·kg?1，全氮10.38g·kg?1，全磷1.14g·kg?1，全鉀14.17g·kg?1，堿解氮94.83mg·kg?1，速效磷49.10mg·kg?1，速效鉀104.28mg·kg?1，pH為8.28。

1.2 供試材料

選用粳稻品種松粳9號（典型特征為高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)，平均產(chǎn)量10.5t·hm?2）和稻花香2號（典型特征為優(yōu)質(zhì)，全部指標(biāo)達(dá)到農(nóng)業(yè)部優(yōu)質(zhì)米一級標(biāo)準(zhǔn)）。松粳9號出苗?成熟需≥10℃活動(dòng)積溫2650℃·d，株高95～100cm，穗長20cm左右；稻花香2號需≥10℃活動(dòng)積溫2800℃·d左右，株高100～105cm，穗長21cm左右。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用miniFACE系統(tǒng)進(jìn)行。設(shè)定2個(gè)CO2濃度水平，分別為大氣CO2（400±40μmol·mol?1）和高CO2的FACE圈（600±60μmol·mol?1），誤差約為10%，各設(shè)3次重復(fù)，即3個(gè)FACE圈，3個(gè)對照圈。采用盆栽試驗(yàn)，盆長55cm，寬40cm，深30cm，裂區(qū)設(shè)計(jì)，每圈種植水稻60盆，兩品種各30盆，每盆播種6穴，每穴精選苗4株。

5月16日育苗，6月15日移栽，同時(shí)開始對FACE圈內(nèi)通CO2氣體至收獲。移栽時(shí)對各盆施尿素4g，磷酸二銨4g，氯化鉀2g，7月6日追加氯化鉀3g。FACE圈與對照圈管理方式相同，移栽前盆土澆透水，水分管理（灌溉時(shí)間）與大田相同。10月2日全部收獲。

1.4 生育期確定

參照國家水稻研究中心水稻生育期的劃分標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合試驗(yàn)實(shí)際情況，兩品種發(fā)育期較接近，8月16日進(jìn)入抽穗開花始期（穗頂端從葉鞘露出并開花），8月20日植株約50%抽穗（抽穗開花盛期），8月28日進(jìn)入齊穗期（植株80%出穗），8月31日進(jìn)入乳熟期（籽粒內(nèi)容物呈白色乳漿狀，背部仍為綠色），9月16日進(jìn)入蠟熟期（籽粒內(nèi)容物濃黏，無乳狀物出現(xiàn)，手壓穗中部籽粒有堅(jiān)硬感，米粒背部綠色逐漸消失，谷殼微黃），9月26日為完熟期（谷殼變黃，不易破碎，可以收獲）。

1.5 測定項(xiàng)目及方法

1.5.1 制樣

抽穗開花初期，各小區(qū)選擇穗型大小基本一致且開花1/3的分蘗穗100個(gè)，于穗上部穎花開花之日在穗頸部掛牌標(biāo)記穎花開花日期。自8月20日起每隔8d各小區(qū)隨機(jī)選取同日開花的掛牌穗10個(gè)，取樣時(shí)間為10：00?12：00，取樣5次，取樣后用鋁箔包裹，放入液氮中冷凍，再裝入自封袋中，在?80℃超低溫冰箱中保存。取樣完畢后進(jìn)行統(tǒng)一測定，各處理3次重復(fù)，測定方法參照李天等[22?23]的方法，略有改進(jìn)。

測定時(shí)每穗選取灌漿基本一致的穗中部強(qiáng)勢粒3粒用于酶活性測定，去內(nèi)外穎，加1mL GS-buffer [100mmol·L?1Hepes-NaOH(pH7.4)、8mmol·L?1MgCl2、2mmol·L?1K2HPO4、2mmol·L?1Na2-EDTA、12.5% (V/V) Glycerol]、0.05g的PVPP（聚乙烯吡咯烷酮）和3.6μL的2-ME（2-巰基乙醇），冰浴研磨，離心10min(2℃，15000r·min?1)，取上清液得到可溶性粗酶液。對沉淀部分加入0.5mL GS-buffer，離心10min，去除上清液，重復(fù)2次，得到的沉淀測定時(shí)加1mL GS-buffer混勻即為不溶性粗酶液。

1.5.2 儀器和耗材

包括紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰和蒸餾水等。

1.5.3 ADPG焦磷酸化酶活性測定

1.5.3.1 測定意義

淀粉的生物合成途徑中，ADPG焦磷酸化酶的作用是將葡萄糖-1-磷酸中的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到ATP上生成ADPG，進(jìn)而合成淀粉，這是淀粉生物合成的重要調(diào)節(jié)位點(diǎn)，是淀粉合成過程中的關(guān)鍵酶[24]。

1.5.3.2 測定原理

ADPG焦磷酸化酶作用機(jī)理為

6-P-葡萄糖脫氫酶是戊糖途徑調(diào)控酶，催化不可逆反應(yīng)，NADPH反饋抑制酶的活性。反應(yīng)中生成的NADPH由于含有二氫吡啶環(huán)，在340nm處有一吸收峰。

1.5.3.3 測定方法

冰浴中，取粗酶液20μL加入230μL反應(yīng)液[100mmol·L?1Hepes-NaOH(pH7.4)、3mmol·L?13-PGA、1.2mmol·L?1ADPG、3mmol·L?1NaH2PO4、5mmol·L?1MgCl2、4mmol·L?1DTT、蒸餾水]，30℃振動(dòng)反應(yīng)20min，100℃沸水中30s終止反應(yīng)，加入450μL蒸餾水, 移至小試管離心（2℃，15000r·min?1）取上清液至3mmol石英比色杯中, 加入10mg·mL?1NADP15μL，覆膜振動(dòng)，紫外分光光度計(jì)測定波長340nm下吸光度，分別加入1μL PGM和G-6-PDH，再次測定波長340nm下吸光度。

1.5.4 淀粉合成酶活性測定

1.5.4.1 測定意義

ADPG生成后，在淀粉合成酶的催化下，葡萄糖殘基以α-1，4糖苷鍵摻入葡聚糖引物的非還原末端，延長一個(gè)葡萄糖單位。根據(jù)在淀粉體中存在狀態(tài)的不同，將淀粉合成酶分為顆粒結(jié)合型淀粉合成酶（Granule-bound starch synthase，GBSS）和可溶性淀粉合成酶（Soluble starch synthase，SSS）[10,25]?？扇苄缘矸酆铣擅钢饕嬖谟谫|(zhì)體的基質(zhì)中，與淀粉分支酶一起合成支鏈淀粉；而顆粒結(jié)合型淀粉合成酶是與直鏈淀粉合成直接有關(guān)的酶。

1.5.4.2 測定原理

可溶性淀粉合成酶作用機(jī)理為

1.5.4.3 測定方法

（1）可溶性淀粉合成酶：冰浴中，取40μL粗酶液加入140μL反應(yīng)液[50mmol·L?1Hepes-NaOH (pH7.4)、15mmol·L?1DTT、1.6mmol·L?1ADPG、20mg·mL?1Glycogen]和100μL蒸餾水，30℃振動(dòng)反應(yīng)40min，100℃沸水中2min終止反應(yīng)。加入100μL反應(yīng)液[50mmol·L?1Hepes-NaOH (pH7.4)、4mmol·L?1PEP、200mmol·L?1KCl、10mmol·L?1MgCl2、2μL Pyruvate kinase]于30℃震動(dòng)反應(yīng)30min，沸水中2min終止反應(yīng)，加入100μL蒸餾水，移入小試管中離心(2℃，15000r·min?1)。取上清至3mmol石英比色杯中, 加入200μL反應(yīng)液[50mmol·L?1Hepes-NaOH( pH7. 4)、20mmol·L?1MgCl2、10mmol·L?1Glucose、2mmol·L?1NADP、20μL蒸餾水]，加入2μL G-6-PDH，于340nm波長下測定吸光度。

（2）顆粒結(jié)合型淀粉合成酶活性：取等量（40μL）不溶性粗酶液，方法同可溶性淀粉合成酶活性測定。

1.5.5 淀粉分支酶測定

1.5.5.1 測定意義

淀粉分支酶（Starch branching enzyme，SBE）又稱Q酶。該酶對淀粉合成具有兩方面意義，首先，使淀粉的α-1，4-糖苷鍵連接的直鏈變?yōu)楹笑?1，6-糖苷鍵連接的支鏈，使葡聚糖的分子量不斷增大，以便讓有限的細(xì)胞空間能容納更多的具有能量的物質(zhì)；第二，α-1，6糖苷鍵的導(dǎo)入使葡聚糖的非還原性末端增加，有利于ADPG焦磷酸化酶和淀粉合成酶的催化反應(yīng)，使它們能在短時(shí)間內(nèi)催化合成更多的淀粉[10]。

1.5.5.2 測定原理

在淀粉合成過程中，淀粉分支酶能切開α-1，4-葡聚糖直鏈供體（直鏈淀粉或支鏈淀粉的直鏈區(qū)）的α-1，4-糖苷鍵并同時(shí)催化所切下的短鏈與受體鏈（原鏈或其他鏈）間α-1，6-糖苷鍵的形成，從而產(chǎn)生分支的糖鏈，促進(jìn)支鏈淀粉的合成。

1.5.5.3 測定方法

冰浴中，取粗酶液40μL加入60μL反應(yīng)液[50mmol·L?1Hepes-NaOH (pH7.4)、1.25mmol·L?1AMP、5mmol·L?1 G1P、3mg·mL?1Phosphorylase]和100μL蒸餾水，30℃下振動(dòng)反應(yīng)30min, 加入100μL HCl終止反應(yīng)，加入500μL DMSO試劑、0.1% I2和700μL濃度為1%的KI，移至3mmol石英比色杯中，于540nm波長下測定吸光度。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

以SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和方差分析，檢驗(yàn)CO2處理和品種間的顯著性差異，用Excel繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2濃度增高對水稻籽粒ADPG焦磷酸化酶活性的影響

在葉綠體內(nèi)淀粉的合成中，ADPG焦磷酸化酶是合成葡萄糖供體ADPG的關(guān)鍵酶。由圖1可見，在兩種CO2濃度下，松粳9號（高產(chǎn)特征）和稻花香2號（優(yōu)質(zhì)特征）籽粒灌漿過程中，ADPG焦磷酸化酶活性均隨灌漿進(jìn)程呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，在開花后23d（乳熟期）觀測時(shí)達(dá)到最大值，但在每8d一次的觀測中，處理間、品種間均有一定的差異。

圖1 兩種CO2濃度處理下兩個(gè)水稻品種開花后籽粒中ADPG焦磷酸化酶活性變化過程的比較

注：FACE為開放式空氣CO2濃度增加，AMB為正常大氣CO2濃度，S為松粳9號，D為稻花香2號。*、**分別表示處理間在0.05、0.01水平上的差異顯著性，ns為不顯著。短線表示均方誤。CO2表示CO2濃度處理間差異顯著性，“品種”表示品種間差異顯著性。下同。

Note: FACE is free air CO2enrichment; AMB is ambient CO2. S is Songjing9; D is Daohuaxiang2.*indicates the difference significance among treatments at 0.05 level, and**indicates the difference significance among treatments at 0.01 level , ns is no significant difference among treatments. CO2indicates the significance of difference among CO2treatments, varieties indicates the significance of difference among two varieties. The bar is mean squared error .The same as below.

圖1顯示，在開花后23d和41d（乳熟期和完熟期）觀測時(shí)，F(xiàn)ACE圈（CO2增高）內(nèi)兩個(gè)水稻品種籽粒中ADPG焦磷酸化酶活性均極顯著高于對照圈（P<0.01），其中松粳9號兩個(gè)處理間在乳熟期差異最大，增幅為29.51%，而稻花香2號兩個(gè)處理間在完熟期差異最大，增幅為21.31%；但在開花后14d（齊穗期）觀測時(shí)，F(xiàn)ACE圈（CO2增高）內(nèi)兩個(gè)水稻品種籽粒中ADPG焦磷酸化酶活性均極顯著低于對照圈（P<0.01），松粳9號和稻花香2號降幅分別為18.58%和7.58%?？梢姡瑢蓚€(gè)水稻品種而言，在齊穗期，CO2增高阻礙了籽粒中ADPG焦磷酸化酶活性的表達(dá)，但在乳熟期和完熟期，CO2增高有利于籽粒中ADPG焦磷酸化酶活性的表達(dá)。

比較兩個(gè)水稻品種籽粒中ADPG焦磷酸化酶活性可見，在兩種CO2濃度條件下，抽穗開花后各發(fā)育期松粳9號籽粒中ADPG焦磷酸化酶活性均高于稻花香2號，且該品種受CO2濃度增高的影響更大，表現(xiàn)最突出的是開花后23d（乳熟期）的觀測結(jié)果，松粳9號胚乳中ADPG 焦磷酸化酶活性峰值（平均為35.61U·grain?1·min?1）比稻花香2號（平均為24.08 U·grain?1·min?1）高47.88%，差異達(dá)極顯著（P<0.01），且在正常大氣CO2濃度和高濃度CO2條件下，胚乳中ADPG 焦磷酸化酶活性峰值品種間差異分別為37.14%和57.38%?？梢?，籽粒灌漿過程，與稻花香2號相比，松粳9號籽粒中ADPG焦磷酸化酶活性更高，且受CO2濃度增高的影響更大。

2.2 CO2濃度增高對水稻籽粒淀粉合成酶活性的影響

2.2.1 可溶性淀粉合成酶活性

可溶性淀粉合成酶游離于造粉體基質(zhì)中，是水稻籽粒中淀粉生物合成的調(diào)節(jié)位點(diǎn)，催化水稻胚乳淀粉合成的一種重要酶。由圖2可見，在兩種CO2濃度條件下，兩個(gè)水稻品種籽粒灌漿過程中可溶性淀粉合成酶活性亦呈先升高后降低的變化趨勢，松粳9號和稻花香2號分別在開花后23d（乳熟期）和32d（蠟熟期）觀測時(shí)活性達(dá)到最大值，且在不同的灌漿進(jìn)程中，品種和處理間存在差異。

圖2顯示，在開花后23～41d（乳熟期?完熟期）觀測時(shí)，F(xiàn)ACE圈（CO2濃度增高）內(nèi)兩水稻品種籽粒中可溶性淀粉合成酶活性均極顯著高于對照圈（P<0.01），其中在開花后23d（乳熟期）兩種CO2濃度處理差異最大，F(xiàn)ACE圈松粳9號籽粒中該酶活性比對照圈內(nèi)高9.55%、稻花香2號高66.67%。可見，對兩個(gè)水稻品種而言，在乳熟期之前，CO2濃度增高對籽粒中可溶性淀粉合成酶活性的表達(dá)影響不大，而乳熟期之后，CO2濃度增高促進(jìn)籽粒中可溶性淀粉合成酶活性的表達(dá)。

圖2 兩種CO2濃度處理下兩個(gè)水稻品種開花后籽?？扇苄缘矸酆铣擅富钚宰兓^程的比較

比較兩個(gè)水稻品種籽粒中可溶性淀粉合成酶活性可見，在兩種CO2濃度條件下，抽穗開花后各發(fā)育期，稻花香2號受CO2濃度增高的影響均更大，表現(xiàn)最突出的是開花后23d（乳熟期），受CO2濃度增高影響增幅達(dá)36.77%；松粳9號胚乳中可溶性淀粉合成酶活性峰值平均為9.31U·grain?1·min?1，比稻花香2號的3.43U·grain?1·min?1高1.72倍，差異達(dá)極顯著（P<0.01），且在正常大氣CO2濃度和高濃度CO2條件下，該酶活性峰值品種間差異分別為2.04倍和1.48倍。同時(shí)，開花后5d和14d（盛花期和齊穗期）觀測的松粳9號籽粒中可溶性淀粉合成酶活性均極顯著（P<0.01）高于稻花香2號，而開花后41d（完熟期）觀測的松粳9號籽粒中該酶活性極顯著（P<0.01）低于稻花香2號?？梢?，籽粒灌漿過程中，稻花香2號籽粒中可溶性淀粉合成酶活性受CO2濃度增高的影響更大，另外，齊穗期之前，松粳9號比稻花香2號活性高，且峰值也高于稻花香2號，但到成熟期，松粳9號活性下降較快。

2.2.2 顆粒型淀粉合成酶活性

顆粒型淀粉合成酶，通過表面結(jié)合或被淀粉粒包裹形式而與淀粉粒結(jié)合存在，與可溶性淀粉合成酶在淀粉體中存在的狀態(tài)不同，是另一種類型的淀粉合成酶。由圖3可見，在兩種CO2濃度條件下，松粳9號和稻花香2號籽粒顆粒型淀粉合成酶活性隨灌漿過程呈先升高后降低的趨勢，開花后14d（齊穗期）活性達(dá)最高值，CO2處理與品種對籽粒顆粒型淀粉合成酶活性的影響存在差異。

圖3顯示，開花后23～32d（乳熟期?蠟熟期）觀測時(shí)，F(xiàn)ACE圈（CO2濃度增高）內(nèi)兩個(gè)水稻品種籽粒中顆粒型淀粉合成酶活性均極顯著高于對照圈（P<0.01），其中，開花后32d（蠟熟期）兩種CO2處理差異最大，F(xiàn)ACE圈松粳9號籽粒中該酶活性比對照圈內(nèi)高25.00%、稻花香2號籽粒中該酶活性比對照圈內(nèi)高34.35%。可見，對兩個(gè)水稻品種而言，乳熟?蠟熟期，CO2濃度增高促進(jìn)籽粒中顆粒型淀粉合成酶活性的表達(dá)。

比較兩個(gè)水稻品種籽粒中顆粒型淀粉合成酶活性可見，在兩種CO2濃度條件下，抽穗開花后各發(fā)育期，稻花香2號籽粒中顆粒型淀粉合成酶活性均高于松粳9號，且該品種受CO2濃度增高的影響更大，增幅差異最明顯的是開花后14d（齊穗期）的觀測結(jié)果，稻花香2號比松粳9號胚乳中顆粒型淀粉合成酶活性峰值（平均為4.26U·grain?1·min?1）比松粳9號（平均為3.29U·grain?1·min?1）高22.78%，差異達(dá)極顯著水平（P<0.01），且在正常大氣CO2濃度和高濃度CO2條件下，該酶活性峰值品種間差異分別為13.53%和30.19%?？梢姡蚜９酀{過程中，稻花香2號比松粳9號籽粒中顆粒型淀粉合成酶活性更高，且受CO2增高的影響更大，其活性峰值也高于松粳9號，在CO2濃度增高條件下兩個(gè)品種水稻的顆粒型淀粉合成酶活性峰值差異更明顯。

圖3 兩種CO2濃度處理下兩個(gè)水稻品種開花后籽粒中顆粒型淀粉合成酶活性變化過程的比較

2.3 CO2濃度增高對水稻籽粒淀粉分支酶活性的影響

直鏈淀粉可在淀粉分支酶作用下最終形成支鏈淀粉。由圖4可見，在兩種CO2條件下，松粳9號和稻花香2號籽粒淀粉分支酶活性在抽穗開花后均呈先升高后降低的趨勢，開花后14d（齊穗期）活性達(dá)高峰，CO2處理與品種對該酶活性的影響存在差異。

圖4顯示，在開花后5、32、41d（盛花期、蠟熟期、完熟期）觀測時(shí)，F(xiàn)ACE圈（CO2濃度增高）內(nèi)兩個(gè)水稻品種籽粒中淀粉分支酶活性均極顯著高于對照圈（P<0.01），其中開花后32d（蠟熟期）兩種CO2濃度處理差異最大，F(xiàn)ACE圈松粳9號籽粒中淀粉分支酶活性比對照高25.15%，稻花香2號比對照高12.09%；但在開花后23d（乳熟期）觀測時(shí)，F(xiàn)ACE圈內(nèi)兩水稻品種籽粒中淀粉分支酶活性極顯著低于對照（P<0.01），松粳9號和稻花香2號降幅分別為9.96%和5.19%?？梢?，對兩個(gè)水稻品種而言，在盛花期、蠟熟期和完熟期，CO2濃度增高有利于籽粒中淀粉分支酶活性的表達(dá)，但阻礙了乳熟期籽粒中淀粉分支酶活性的表達(dá)。

比較兩個(gè)水稻品種籽粒中淀粉分支酶的活性可見，在兩種CO2條件下，抽穗開花后各發(fā)育期，觀測的稻花香2號籽粒中淀粉分支酶活性均高于松粳9號，且稻花香2號胚乳中該酶活性峰值（平均為0.72U·grain?1·min?1）比松粳9號（平均為0.63U· grain?1·min?1）高11.71%，二者差異達(dá)極顯著水平（P<0.01），且在正常大氣CO2濃度和高濃度CO2條件下，胚乳中該酶活性峰值品種間差異分別為15.95%和7.27%。同時(shí)，開花后23d和32d（乳熟期和蠟熟期）觀測的籽粒中該酶活性松粳9號比稻花香2號受CO2濃度增高影響較大，而開花后5d、14d、41d（盛花期、齊穗期和完熟期）兩個(gè)品種均受CO2濃度增高影響較大?？梢?，籽粒灌漿過程，稻花香2號比松粳9號籽粒中淀粉分支酶活性更高，且活性峰值也高于松粳9號；另外，隨著灌漿進(jìn)程的變化，兩個(gè)水稻品種籽粒中淀粉分支酶活性受CO2增高影響程度有較大差異。

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

CO2作為卡爾文循環(huán)的底物在籽粒碳代謝中起重要作用，碳以CO2的形態(tài)進(jìn)入并以糖的形態(tài)離開卡爾文循環(huán)，整個(gè)循環(huán)是以ATP作為能量來源在一系列酶的催化作用下來制造糖[26]。本研究表明，CO2增高使淀粉代謝相關(guān)酶的活性發(fā)生了一系列變化，說明CO2增高對淀粉合成相關(guān)酶的活性有明顯影響，且不同程度地提高淀粉合成過程中各酶活性的峰值，而活性峰值的大小可決定酶活性的最強(qiáng)表達(dá)能力。

圖4 兩種CO2濃度處理下兩個(gè)水稻品種開花后籽粒中淀粉分支酶活性變化過程的比較

ADPG焦磷酸化酶是淀粉合成代謝過程中涉及的第一個(gè)限速酶[27?28]，通過消耗ATP催化葡萄糖供體ADPG的合成，乳熟期活性達(dá)最高，說明乳熟期是兩個(gè)水稻品種ADPG合成量差異的關(guān)鍵階段，且CO2濃度增高使該酶活性峰值有所提高，有利于合成更多的ADPG供給后期淀粉合成，且松粳9號的反應(yīng)較稻花香2號更敏感，說明CO2濃度增高對高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)型品種松粳9號的影響相比優(yōu)質(zhì)型品種稻花香2號更明顯，可能較大程度地增強(qiáng)高產(chǎn)品種的ADPG焦磷酸化酶活性。雖然CO2濃度增高降低了齊穗期籽粒ADPG焦磷酸化酶活性，對此期酶活性的表達(dá)有抑制作用，但到了乳熟期和完熟期該酶活性均有所提高，且乳熟期增幅最大，說明CO2濃度增高對乳熟期ADPG焦磷酸化酶活性提高的促進(jìn)作用更顯著，原因可能是高濃度CO2促進(jìn)卡爾文循環(huán)活化更多的CO2分子，在CO2濃度增加條件下，植物充分利用環(huán)境資源，增加對CO2的固定作用，需要通過提高初始酶活性來滿足碳同化時(shí)的需求。淀粉合成酶催化合成直鏈淀粉，CO2增高顯著提高乳熟?完熟期兩個(gè)水稻品種的可溶性和顆粒型淀粉合成酶活性，且稻花香2號增幅較大，乳熟期是影響直鏈淀粉合成的關(guān)鍵階段，乳熟期ADPG焦磷酸化酶活性的提高會(huì)產(chǎn)生更多的ADPG，部分進(jìn)入三羧酸循環(huán)促進(jìn)ATP含量增加，進(jìn)而促進(jìn)淀粉合成酶活性的表達(dá)，說明高濃度CO2可能一定程度上促進(jìn)直鏈淀粉的合成，且稻花香2號直鏈淀粉合成能力顯著高于松粳9號。淀粉分支酶主要催化合成支鏈淀粉，盛花期、蠟熟期和完熟期，CO2濃度增高顯著提高籽粒淀粉分支酶活性，原因可能是氣孔萎縮減少光呼吸對能源ATP的利用，植物通過提高酶活性增加對底物的利用，該酶活性的提高還有利于ADPG焦磷酸化酶和淀粉合成酶的催化反應(yīng)；CO2增高僅降低乳熟期該酶的活性，高濃度CO2可能抑制該時(shí)期的呼吸活性，從而降低淀粉分支酶對支鏈淀粉合成的催化作用。

另外，籽粒灌漿過程中，品種間淀粉合成相關(guān)酶活性差異較大，稻花香2號顆粒型淀粉合成酶和淀粉分支酶活性較高，說明該品種催化支鏈淀粉合成能力更強(qiáng)，松粳9號ADPG焦磷酸化酶和可溶性淀粉合成酶活性較高，說明該品種催化直鏈淀粉合成能力更強(qiáng)。

3.2 結(jié)論

灌漿期是籽粒淀粉形成的關(guān)鍵時(shí)期，本研究發(fā)現(xiàn)，隨著灌漿進(jìn)程的推進(jìn)，松粳9號和稻花香2號兩水稻淀粉合成相關(guān)酶活性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，酶活性達(dá)峰值時(shí)間略有差異，其中顆粒型淀粉合成酶和淀粉分支酶活性峰值出現(xiàn)在齊穗期，ADPG焦磷酸化酶和可溶性淀粉合成酶活性在乳熟期達(dá)最大值，稻花香2號略偏晚。這與以往對水稻籽粒淀粉合成關(guān)鍵酶活性研究的趨勢性結(jié)論一致[28?30]。本研究結(jié)果顯示，對兩水稻品種而言，CO2濃度增高對不同灌漿進(jìn)程中酶活性的影響程度有顯著差異，其中ADPG焦磷酸化酶、可溶性和顆粒型淀粉合成酶，在乳熟期之后有利于酶活性的表達(dá)；而對于淀粉分支酶，CO2濃度增高阻礙了乳熟期籽粒中該酶活性的表達(dá)，但在盛花期、蠟熟期和完熟期，促進(jìn)了淀粉分支酶活性的表達(dá)。

籽粒灌漿過程中，淀粉合成相關(guān)酶活性亦存在品種間差異，顆粒型淀粉合成酶和淀粉分支酶活性稻花香2號比松粳9號高，且活性峰值也高于松粳9號，而ADPG焦磷酸化酶活性則表現(xiàn)為松粳9號比稻花香2號高，且峰值也高于稻花香2號，可溶性淀粉合成酶活性僅在齊穗期之前松粳9號比稻花香2號活性高。CO2濃度增高對兩個(gè)水稻品種籽粒中酶活性影響亦有顯著差異，松粳9號籽粒中ADPG焦磷酸化酶活性對CO2濃度增高的反應(yīng)較敏感，而稻花香2號可溶性淀粉合成酶和顆粒型淀粉合成酶活性受CO2濃度增高的影響更大，淀粉分支酶活性隨灌漿進(jìn)程的變化，兩個(gè)水稻品種籽粒中該酶活性受CO2濃度增高影響程度有一定差異。

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Effect of Elevated CO2to Starch Metabolizing Enzyme Activities in Grains of Rice

WANG Hui-zhen1, WU Rong-sheng1, LIN Ru-gang2, HAN Xue3

(1. Inner Mongolia Ecological and Agricultural Meteorological Center, Hohhot 010051, China; 2. Institute of Environment and Sustainable Development in Agriculture, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081; 3. Inner Mongolia Meteorological Bureau, Hohhot 010051)

Free-air CO2Enrichment (FACE) experimental system was conducted to find out the change trend of relevant enzymes activity about grain starch synthesis in atmospheric CO2concentration, using high yield and good qualityvarieties Songjing 9 and Daohuaxiang 2. It was treated with two atmospheric CO2concentrations: elevated carbon dioxide(600±60μmol·mol?1) and ambient carbon dioxide(400±40μmol·mol?1). The ADPG pyrophosphorylase enzyme activity, starch synthase enzyme activity and starch branching enzyme activity in grains of two rice varieties were measured after flowering. The results showed that the effect of elevated CO2on the enzyme activity during different grain-filling processes was significantly different, which obviously promoted the expression of ADPG pyrophosphorylase enzyme, soluble and granular starch synthase enzyme activity after the milky stage, but only hindered the expression of starch branching enzyme activity in the grain endosperm at milky stage. Meanwhile, response of starch metabolizing enzyme to elevated CO2had the genotypic difference with different rice varieties. For the activity of ADPG pyrophosphorylase enzyme, Songjing9 was more affected by elevated CO2, while Daohuaxiang2 was more affected by elevated CO2for the activity of starch synthase enzyme. The conclusion showed that there was an obvious time characteristics about the influence degree of elevated CO2to expression of the key enzyme activity during the starch biosynthetic pathway, with the advancement of grouting process. Response degree of different varieties rice on elevated CO2existed significant differences. Overall, atmospheric CO2concentration could promote the synthesis of starch in a certain extent.

Elevated CO2;Free-air carbon dioxide enrichment(FACE); Rice; ADPG pyrophosphorylase enzyme; Starch synthase enzyme; Starch branching enzyme

10.3969/j.issn.1000-6362.2019.04.004

2018?10?15

中國氣象局氣候變化專項(xiàng)(CSF201606)；國家自然科學(xué)基金（41505100）

王惠貞（1988－），女，工程師，研究方向?yàn)檗r(nóng)業(yè)氣象。E-mail: whz0301@163.com

王惠貞,武榮盛,藺汝罡,等.CO2濃度增高對水稻籽粒淀粉代謝相關(guān)酶活性的影響[J].中國農(nóng)業(yè)氣象,2019,40(4):230-239