丁婉雪，葛瑞瑞，黃金玲，周 鵬，王 靚，甘賢兵，施 慧，范曉蕓

(1.安徽中醫(yī)藥大學研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院，安徽 合肥 230012；3.中藥復方安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012；4.安徽中醫(yī)藥大學護理學院，安徽 合肥 230012)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后心室重構與血流動力學、氧化應激、炎癥反應等因素有關，其中氧化應激在AMI后心室重構發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[1]。氧化應激損傷主要是心肌細胞缺血低氧條件下氧自由基大量生成，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物增多，抗氧化酶不斷消耗，抗氧化能力減弱，進而導致細胞凋亡，促進心室重構的發(fā)生[2-3]。苓桂術甘湯出自張仲景《傷寒論》，是溫陽益氣、健脾化飲的經(jīng)典名方。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，該方能調(diào)節(jié)心力衰竭大鼠的神經(jīng)內(nèi)分泌細胞因子的分泌，改善血流動力學指標，阻抑心室重構，改善心功能[4-5]。本研究在前期基礎上深入探討苓桂術甘湯對H2O2導致心肌細胞氧化應激損傷及心肌細胞凋亡的影響。

1 材料

1.1 動物 雄性SD大鼠40只、體質(zhì)量為(200±20)g，SD乳鼠20只(1日齡)，均購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2017-001]。

1.2 藥物 ①苓桂術甘湯：茯苓(批號 20170403)、桂枝(批號 20170312)、白術(批號 20170213)和甘草(批號 20170410)購自安徽普仁中藥飲片有限公司。苓桂術甘湯按原方比例(茯苓、桂枝、甘草、白術質(zhì)量比為4∶3∶3∶2)并參考文獻[6]方法，由安徽省亳州市興和藥業(yè)有限公司制備成干燥粉末(每克干燥粉末含生藥4.8 g)，分裝密封，避光保存?zhèn)溆?。②含藥血清制備：將SD大鼠隨機分為正常對照組和給藥組。給藥組用苓桂術甘湯8.4 g/kg(按照體表面積法計算相當于成人日常用量4倍)灌胃給藥，每日2次，連續(xù)灌胃7 d，末次給藥后45 min，經(jīng)腹主動脈取血，靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清，56 ℃水浴30 min滅活補體，0.22 μm濾膜過濾除菌，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑 H2O2(批號 20170901)：德州安捷高科有限公司；膠原酶Ⅱ(批號 EC0111)：美國Sigma公司；Hoechst 33258(批號 20160527)、甲基四唑藍(MTT)(批號 1117X057)：北京索萊寶生物公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒(批號 P0012)、丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)試劑盒(批號 S0101)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)試劑盒(批號 S0131)、谷胱甘肽過氧化酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒(批號 C0016)和氧自由基試劑盒(批號 S0033)：碧云天生物試劑公司；兔抗大鼠抗體α-actin(批號 11163647S)：北京博奧森生物；山羊抗兔IgG二抗Cy3熒光標記(批號 ATQJA1701)：美國Abbkine公司；Annexin Ⅴ-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(批號 20171208)：上海貝博生物有限公司。

1.4 儀器設備 3111型恒溫CO2培養(yǎng)箱：美國Thermo；Ⅸ81熒光倒置顯微鏡：日本Olympus；Accuri C6流式細胞儀：美國 Becton Dickinson；ATOM酶聯(lián)免疫工作站：意大利MAROCHE。

2 方法

2.1 心肌細胞分離與培養(yǎng) 參考文獻[7]采用差速貼壁法。取1日齡SD乳鼠，無菌取心臟，用PBS漂洗3次，加入胰蛋白酶，4 ℃過夜；加入等量完全培養(yǎng)基；再加入膠原酶Ⅱ消化液消化15 min；加入與消化液等量的完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，加入含BrdU(終濃度為1 mmol/L)的完全培養(yǎng)基制成細胞懸液，置于培養(yǎng)箱，90 min后收集未貼壁的心肌細胞，24 h后更換為含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)液，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)至72 h。

2.2 原代心肌細胞鑒定 取培養(yǎng)至72 h的原代心肌細胞，以3×105/mL的細胞密度種于6孔板。待細胞貼壁后。加入4%多聚甲醛固定30 min；Trinton室溫孵育20 min，室溫封閉1 h；棄上清液，加入一抗α-actin(1∶200)，4 ℃過夜孵育；加入Cy3二抗(1∶200)，避光孵育1 h；Hoechst染核10 min；倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.3 分組及模型復制 取分離培養(yǎng)72 h的心肌細胞，分為6組：正常對照組，空白血清(20%)組、H2O2模型組、苓桂術甘湯含藥血清(5%、10%、20%)組培養(yǎng)12 h后，用H2O2100 μmol/L作用于心肌細胞6 h。

2.4 觀察指標及檢測方法

2.4.1 細胞活性檢測 取分離培養(yǎng)72 h的心肌細胞，用完全培養(yǎng)液調(diào)密度至105/mL，接種于96孔板，每組設5個復孔，正常對照組及H2O2模型組加入完全培養(yǎng)液，空白血清組加入含20%正常大鼠血清的完全培養(yǎng)液，其余各組分別加入含有5%、10%和20%苓桂術甘湯含藥血清的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。除正常對照組加入完全培養(yǎng)液外，其余各組均加入含H2O2(100 μmol/L)的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，每孔加入MTT(0.5 mg/mL)20 μL，置于培養(yǎng)箱4 h。加DMSO 150 μL，緩搖10 min，在酶標儀490 nm波長下檢測吸光度(absorbance，A)值，計算細胞活性。細胞活性=實驗組A值/對照組A值×100%。

2.4.2 心肌細胞SOD、GSH-Px、LDH活性及MDA水平檢測 取分離培養(yǎng)72 h的原代心肌細胞，以5×105/mL的密度接種于6孔板，分組同“2.3”項，用樣品勻漿液分別提取細胞，取上清液，根據(jù)試劑盒操作，測定各組細胞中LDH、SOD、GSH-Px及MDA的A值，計算LDH、SOD和GSH-Px酶活性及MDA水平。

2.4.3 心肌細胞凋亡形態(tài)學觀察 參考文獻[8]用免疫熒光染色法觀察心肌細胞凋亡形態(tài)。取分離培養(yǎng)72 h的原代心肌細胞，以3×105/mL的密度接種于6孔板，分組及處理同“2.4.1”項。經(jīng)處理后，用4%多聚甲醛固定細胞30 min，每孔加入Hoechst 33258染色液，室溫下避光染色5 min；倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2.4.4 心肌細胞凋亡率檢測 取分離培養(yǎng)72 h原代心肌細胞，按1×106/mL的密度接種于6孔板，分組及處理同“2.4.1”項。經(jīng)處理后，按Annexin Ⅴ-FITC/PI檢測試劑盒進行操作，流式細胞儀檢測，檢測結果用Flow Jo 7.6 軟件分析。

2.4.5 心肌細胞氧自由基水平測定 取分離培養(yǎng)72 h原代心肌細胞，以5×105/mL接種于6孔板，分組及處理同“2.4.1”項。各組細胞經(jīng)處理后，加入DCFH-DA(10 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)30 min，收集細胞，流式細胞儀檢測，檢測結果用Flow Jo 7.6軟件分析。

3 結果

3.1 原代心肌細胞觀察與鑒定 分離培養(yǎng)24 h后心肌細胞開始貼壁生長，由散在圓形變?yōu)樗笮巍ＩL至72 h，可見細胞交互成網(wǎng)。Cy3標記的α-actin蛋白在心肌細胞胞漿中表達，染色呈紅色(圖1A)；細胞核染色后發(fā)出藍色熒光(圖1B)，兩圖合成，心肌細胞的陽性率大于90%(圖1C)。

注:A.α-actin特異性蛋白表達;B.Hoechst 33258染色的細胞核;C.A圖和B圖的合成圖

圖1免疫熒光化學染色法鑒定心肌細胞(10×20倍)

3.2 對H2O2誘導的氧化損傷心肌細胞活力的影響 與正常對照組比較，H2O2模型組細胞活力明顯降低(P<0.05)；與H2O2模型組比較，各苓桂術甘湯含藥血清組心肌細胞活力均明顯增強(P<0.05)；苓桂術甘湯含藥血清組間細胞活力比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明苓桂術甘湯含藥血清對H2O2誘導的心肌細胞損傷具有保護作用。見表1。

3.3 苓桂術甘湯含藥血清對H2O2損傷的心肌細胞LDH、SOD、GSH-Px活性和MDA水平的影響 與正常對照組比較，H2O2模型組SOD及GSH-Px活性明顯降低(P<0.05)，MDA水平及LDH活性顯著增加(P<0.05)。與H2O2模型組比較，苓桂術甘湯含藥血清組心肌細胞SOD及GSH-Px活性明顯增加，LDH活性及MDA水平顯著降低(P<0.05)。表明苓桂術甘湯含藥血清能抑制心肌細胞MDA生成及LDH活性，提高SOD及GSH-Px活性，且具有濃度依賴性，對心肌細胞氧化應激損傷具有保護作用。見圖2。

表1 苓桂術甘湯含藥血清對H2O2損傷心肌細胞活力的影響

注：與正常對照組比較，*P<0.05；與H2O2模型組比較，#P<0.05；與5%苓桂術甘湯含藥血清組比較，△P<0.05；與10%苓桂術甘湯含藥血清組比較，◇P<0.05

注：A.正常對照組；B. H2O2模型組；C. 20%空白大鼠血清組；D. 5%苓桂術甘湯含藥血清組；E. 10%苓桂術甘湯含藥血清組；F. 20%苓桂術甘湯含藥血清組；與正常對照組比較，*P<0.05；與H2O2模型組比較，#P<0.05；與5%苓桂術甘湯含藥血清組比較，△P<0.05；與10%苓桂術甘湯含藥血清組比較，◇P<0.05

3.4 苓桂術甘湯含藥血清對H2O2損傷心肌細胞凋亡的影響

3.4.1 苓桂術甘湯含藥血清對凋亡心肌細胞形態(tài)的影響 熒光顯微鏡下正常對照組心肌細胞核質(zhì)均勻、形狀為橢圓形且呈較弱的藍色熒光；與正常對照組比較，H2O2模型組心肌細胞的核濃染、熒光增強、顏色發(fā)白，呈現(xiàn)凋亡細胞特征；與H2O2模型組比較，苓桂術甘湯含藥血清(10%、20%)組熒光強度減弱、核染色變淺。表明苓桂術甘湯含藥血清能夠抑制H2O2誘導的心肌細胞凋亡。見圖3。

注：A.正常對照組；B. H2O2模型組；C. 20%空白大鼠血清組；D. 5%苓桂術甘湯含藥血清組；E. 10%苓桂術甘湯含藥血清組；F. 20%苓桂術甘湯含藥血清組

圖3苓桂術甘湯含藥血清對H2O2損傷的心肌細胞凋亡形態(tài)的影響(Hoechst 33258染色，10×20倍)

3.4.2 苓桂術甘湯含藥血清對H2O2損傷的心肌細胞凋亡率的影響 與正常對照組比較，H2O2模型組心肌細胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與H2O2模型組比較，苓桂術甘湯含藥血清組細胞凋亡率均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，苓桂術甘湯含藥血清各組之間細胞凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結果表明苓桂術甘湯含藥血清可抑制H2O2損傷的心肌細胞凋亡。見圖4。

3.5 苓桂術甘湯含藥血清對H2O2損傷的心肌細胞氧自由基水平的影響 與正常對照組比較，H2O2模型組心肌細胞中氧自由基水平明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與H2O2模型組比較，苓桂術甘湯各含藥血清組心肌細胞氧自由基水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；苓桂術甘湯含藥血清各組之間氧自由基水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明苓桂術甘湯含藥血清能顯著降低H2O2誘導的心肌細胞氧自由基的釋放，在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴性。見圖5。

4 討論

心室重構是AMI后常見的進行性病理過程，與心律失常、心力衰竭等不良預后密切相關[9]，氧化應激是導致心室重構和心力衰竭的重要因素[10]。研究表明，在缺血低氧條件下，氧自由基產(chǎn)生和清除的動態(tài)失衡，活性氧產(chǎn)生的速率大于被清除的速率，造成氧自由基的蓄積，氧自由基對細胞產(chǎn)生直接的損害，可導致心肌細胞凋亡而促進心室重構的發(fā)生[2-3，11]。

注：A.正常對照組；B. H2O2模型組；C. 20%空白大鼠血清組；D. 5%苓桂術甘湯含藥血清組；E. 10%苓桂術甘湯含藥血清組；F. 20%苓桂術甘湯含藥血清組；與正常對照組比較，*P<0.05；與H2O2模型組比較，#P<0.05；與5%苓桂術甘湯含藥血清組比較，△P<0.05；與10%苓桂術甘湯含藥血清組比較，◇P<0.05

氧自由基和MDA是氧化應激的主要產(chǎn)物，其水平的高低反映細胞受自由基攻擊和損傷的程度[12]。H2O2是體內(nèi)氧自由基的一種，能自由通過細胞膜，與胞內(nèi)的鐵離子反應生成羥自由基等活性更強的自由基[13]，進而改變抗氧化酶的活性和細胞膜的通透性。GSH-Px和SOD是細胞內(nèi)重要的抗氧化酶，GSH-Px可促進H2O2分解為O2和H2O，SOD可清除體內(nèi)積聚的氧自由基，與氧化應激水平呈負相關。LDH是細胞內(nèi)的糖酵解酶，廣泛存在于細胞漿內(nèi)，LDH漏出增加提示細胞遭到破壞或細胞膜通透性增加，其漏出量反映細胞膜的受損程度[14-15]。

注：A.正常對照組；B. H2O2模型組；C. 20%空白大鼠血清組；D. 5%苓桂術甘湯含藥血清組；E. 10%苓桂術甘湯含藥血清組；F. 20%苓桂術甘湯含藥血清組；與正常對照組比較，*P<0.05；與H2O2模型組比較，#P<0.05；與5%苓桂術甘湯含藥血清組比較，△P<0.05；與10%苓桂術甘湯含藥血清組比較，◇P<0.05

本研究顯示，在H2O2作用下，心肌細胞活力明顯降低，細胞GSH-Px和SOD活性顯著下調(diào)，LDH活性和MDA、氧自由基水平明顯上調(diào)，細胞核濃染數(shù)目增加，細胞凋亡率明顯升高，表明H2O2造成了心肌細胞氧化應激損傷和細胞凋亡；而苓桂術甘湯則能夠提升H2O2誘導損傷模型心肌細胞GSH-Px、SOD的活性，降低細胞MDA、氧自由基水平和LDH活性，抑制心肌細胞凋亡，增強心肌細胞活力，提示苓桂術甘湯可通過提升抗氧化酶活性，提高細胞內(nèi)氧自由基清除效率，改善H2O2誘導的氧化應激損傷，抑制心肌細胞凋亡，保護心肌細胞。

綜上所述，本研究證實苓桂術甘湯可通過改善氧化應激水平而有效抑制心肌細胞損傷和凋亡，這一過程與苓桂術甘湯增強心肌細胞抗氧化酶活性和抑制細胞膜損傷有關，但其作用的具體途徑尚不十分清楚，有待進一步研究。