盛晨鳴，施曉艷，丁澤賢，陳云娜，彭代銀，陳衛(wèi)東

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院，安徽 合肥 230012)

桑葉為?？浦参锷?MorusalbaL.)的干燥葉，中醫(yī)又稱“鐵扇子”。《神農(nóng)本草經(jīng)》最早記載其“氣味苦甘寒，有小毒，主寒熱出汗”，具有疏散風(fēng)熱的功效，可用于治療風(fēng)熱感冒[1]。此外，《本草綱目》有明確記載：“桑葉乃手、足陽明之藥，治勞熱咳嗽，明目長發(fā)，止消渴?！爆F(xiàn)代研究表明，桑葉具有降血糖[2]、降血脂[3]等作用，是臨床常見的中藥之一。

隨著臨床上聯(lián)合用藥現(xiàn)象的普遍化，藥物間發(fā)生相互作用的頻率也越來越大。代謝性相互作用主要是由于藥物對代謝酶產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用所致，細(xì)胞色素P450酶(cytochrome P450，CYP450)起著重要作用[4]。藥物代謝酶被抑制或者誘導(dǎo)是引發(fā)藥物相互作用的關(guān)鍵機(jī)制。據(jù)統(tǒng)計(jì)有70%藥物相互作用是由于代謝酶被抑制所引起的，代謝酶被誘導(dǎo)的約占23%，其他約占7%[5]。

本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-9]，采用“Cocktail”探針?biāo)幬锓ㄑ芯可Ｈ~水提物(aqueous extract of mulberry leaves，AML)和桑葉醇提物(ethanol extract of mulberry leaves，EML)對大鼠體內(nèi)CYP450同工酶活性的影響。通過使用安非他酮、非那西丁、雙氯酚酸鈉這3種探針底物初步探討桑葉提取物對大鼠體內(nèi)CYP450酶活性的影響。

1 材料

1.1 儀器 超高液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國 Agilent 公司；API 4500 3Q/MS，美國AB SCIEX公司。TG16-WS 臺式高速離心機(jī)：長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；KAB135-S型十萬分之一電子天平：德國METTLER TOLEDO公司；XW-80A 微型旋渦混合儀：上海滬西分析儀器廠有限公司；LC-4016 型低速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.2 藥品與試劑 桑葉采摘于安徽省大別山地區(qū)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)俞年軍教授鑒定為桑科植物MorusalbaL.的干燥葉。非那西丁(純度≥98.0%，批號 100095-201502)、雙氯酚酸鈉(純度≥99.9%，批號 10033-200302)、安非他酮(純度≥99.9%，批號 100671-200301)標(biāo)準(zhǔn)品：中國食品藥品檢定研究院；格列本脲標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98.0%，批號 10238-21-8)：上海源葉生物科技有限公司；氯化鈉注射液(批號 L216061408)：安徽豐原藥業(yè)有限公司；甲酸：江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司；鹽酸：上海振企化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙腈(色譜純)：德國Merck公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物 24只SD雄性大鼠，體質(zhì)量為(200±20)g ，由安徽醫(yī)科大學(xué)試驗(yàn)動物中心[生產(chǎn)許可證號為SCXK(皖)2011-002]提供。動物飼養(yǎng)環(huán)境:相對濕度(50±5)%，溫度(25±2)℃。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流動相：0.1%甲酸水溶液-乙腈；梯度洗脫程序：0.01～1 min，10%～80%乙腈；1～1.3 min，80%乙腈；1.3～2.0 min，80%～95%乙腈；2.0～3.0 min，95%～90%乙腈；3.0～3.5 min，90%乙腈，3.5～5.0 min，90%～10%乙腈。流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣體積：2 μL；柱溫：30 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件 離子化方式：電噴霧離子化(electron spray ionization,ESI)，電多反應(yīng)離子檢測(multiple reaction monitoring，MRM)。毛細(xì)管電壓：3.60 kV，離子源溫度：400 ℃，去溶劑化溫度：500 ℃。各成分質(zhì)譜相關(guān)參數(shù)，見表1。

表1 探針?biāo)幬锛皟?nèi)標(biāo)格列本脲的質(zhì)譜相關(guān)參數(shù)

2.3 溶液配制

2.3.1 桑葉提取物的制備 AML：取適量桑葉與鹽酸水溶液(pH=2)按料液比1∶25，在70 ℃條件下回流提取2次，每次2.5 h，合并濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后進(jìn)行真空干燥；EML：取適量桑葉與95%乙醇按料液比1∶15，回流提取2次，提取溫度為85 ℃，每次1.5 h，合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀后真空干燥。臨用前AML組用9.0 g/L氯化鈉注射液(normal saline，NS)，EML組用羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium，CMC)配制成0.2 g/mL(以桑葉生藥量計(jì))備用。

2.3.2 探針底物混合溶液的配制 在避光條件下分別精密稱取安非他酮、非那西丁、雙氯酚酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品15.04、15.12、14.99 mg置于50 mL棕色容量瓶中，精密加入0.50 mL無水乙醇，滴加20 μL吐溫-80助溶，用生理鹽水定容至刻度后混勻，超聲，配制成質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL的“Cocktail”混合探針?biāo)幬锶芤海瑢?shí)驗(yàn)當(dāng)天現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.3.3 內(nèi)標(biāo)溶液配制 在避光條件下精密稱取格列本脲對照品5 mg置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶液先溶解后定容至刻度，混勻配制成500 μg/mL的格列本脲儲備液。吸取格列本脲溶液適量，用甲醇稀釋配制成500 ng/mL的格列本脲內(nèi)標(biāo)溶液。

2.4 分組給藥及樣品采集 將24只SD雄性大鼠隨機(jī)分為EML組、AML組、NS組、CMC組，每組6只。適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后于每日早晨按照1 g/kg給藥量灌胃桑葉提取物溶液，NS組灌胃相同容積的NS，CMC組灌胃相同容積的0.5% CMC。連續(xù)給藥14 d，第14天給藥30 min后，4組大鼠均尾靜脈注射“Cocktail”探針底物混合溶液，給藥劑量為1 mg/kg。尾靜脈注射探針底物混合溶液后的0.05、0.08、0.17、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12 h，眼底靜脈叢取血200 μL至已提前備好的肝素化離心管中，3 500 r/min離心15 min，取血漿上清液，放于-80 ℃冰箱保存。

2.5 血漿樣品處理方法 本實(shí)驗(yàn)采用蛋白沉淀法處理血漿樣品，精密吸取90 μL血漿樣品置1.5 mL離心管中，精密加入10 μL已配制的格列本脲內(nèi)標(biāo)溶液，再加入300 μL甲醇溶液，1 500 r/min渦旋5 min，12 000 r/min高速離心10 min，取80 μL上清液置于進(jìn)樣小瓶中進(jìn)樣分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 根據(jù)在不同時間點(diǎn)采血后得出的各組探針?biāo)幬锏难帩舛?，使用Origin 8.0軟件對血藥濃度-時間曲線進(jìn)行擬合，使用DAS 2.0軟件擬合相關(guān)藥物代謝動力學(xué)參數(shù)包括機(jī)體總清除率(clearance，CL)、藥時曲線下面積(area under the curve，AUC)、生物半衰期(biological half time，t1/2)等。用SPSS 21.0 軟件對各探針?biāo)幬锏乃幬锎x動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法對AML與NS組、EML與CMC組的藥物代謝動力學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 方法學(xué)驗(yàn)證

3.1 專屬性考察 取大鼠空白血漿混合液，大鼠空白血漿加混合探針?biāo)幬锛觾?nèi)標(biāo)混合液，以及尾靜脈注射混合探針?biāo)幬锖蟠笫笱獫{，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，采用“2.1”項(xiàng)下方法分析。結(jié)果表明，大鼠血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾色譜分析。

3.2 線性范圍考察 精密吸取大鼠空白血漿90 μL，各加入一系列不同濃度的混合探針?biāo)幬锶芤?0 μL，制備成安非他酮、非那西丁、雙氯酚酸鈉的系列濃度血漿樣品，按“2.5”項(xiàng)下方法處理血漿樣品，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測定，記錄各個峰面積，橫坐標(biāo)(x)為血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/mL)，縱坐標(biāo)(y)為對照品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比，繪制各探針底物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各線性回歸方程，結(jié)果見表2。

表2 大鼠血漿中3種探針?biāo)幬锏幕貧w方程和回歸系數(shù)

3.3 精密度和準(zhǔn)確度考察 取適量探針?biāo)幬锘旌先芤?，配?份混合探針?biāo)幬锏母?、中、低、定量下?個濃度的質(zhì)控樣品，按“2.5”項(xiàng)下方法處理，采用“2.1”項(xiàng)下方法分析依次進(jìn)樣測定。分別于一日內(nèi)測定多次及連續(xù)3 d內(nèi)測定3次，記錄各個峰面積并計(jì)算各探針底物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，代入“3.2”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線中得出各探針底物的濃度，計(jì)算實(shí)際測得量與加入量的比值，從而計(jì)算準(zhǔn)確度及日間、日內(nèi)精密度。結(jié)果表明該方法測得探針底物血漿樣品的日內(nèi)及日間精密度均良好，能夠滿足本實(shí)驗(yàn)中生物樣品的分析要求。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.5”項(xiàng)下方法操作，經(jīng)血漿樣品處理后混合探針?biāo)幬锏母摺⒅?、低、定量下?個濃度的質(zhì)控樣品，分別考察血漿樣品在室溫放置2 h以及反復(fù)凍融3次的短期穩(wěn)定性，以及在-80 ℃條件下放置20 d情況下的長期穩(wěn)定性，依次進(jìn)樣測定。結(jié)果表明穩(wěn)定性良好，滿足生物樣品分析要求。

3.5 基質(zhì)效應(yīng)考察 取來自不同大鼠的空白血漿90 μL，分別加入各個不同濃度的探針底物混合溶液10 μL，配制成含安非他酮、非那西丁、雙氯酚酸鈉的高、中、低標(biāo)準(zhǔn)添加SD大鼠的血漿樣本，每個濃度配制6份，然后按“2.5”項(xiàng)下方法處理血漿樣品，按“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測定，記錄安非他酮、非那西丁、雙氯酚酸鈉的峰面積均為A1。另外用90 μL水代替SD大鼠空白血漿，其他步驟同上，記錄安非他酮、非那西丁、雙氯酚酸鈉峰面積均為A2，則安非他酮、非那西丁、雙氯酚酸鈉的基質(zhì)效應(yīng)的計(jì)算公式均為(A1/A2)×100%。采用同樣的方法計(jì)算內(nèi)標(biāo)格列苯脲峰面積并計(jì)算其基質(zhì)效應(yīng)。由結(jié)果可知，探針底物及內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)均在(100±5)%之間，即離子強(qiáng)度對本試驗(yàn)結(jié)果測定不產(chǎn)生干擾，能夠滿足底物定量分析的要求。

4 結(jié)果

4.1 探針?biāo)幬锏臐舛?時間曲線 4組大鼠尾靜脈探針?biāo)幬锖?，將不同的采血點(diǎn)所得的血漿樣品按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，使用Origin 8.0軟件對血藥濃度-時間曲線進(jìn)行擬合，結(jié)果見圖1。

注：A. AML組非那西??；B. EML組非那西丁；C. AML組安非他酮；D. EML組安非他酮；E. AML組雙氯酚酸鈉；F. EML組雙氯酚酸鈉

圖1探針底物在大鼠體內(nèi)的濃度-時間曲線

表3 桑葉提取物對非那西丁在大鼠體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)參數(shù)的影響

注：與NS組比較，*P<0.05

表4 桑葉提取物對安非他酮在大鼠體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)參數(shù)的影響

與CMC組比較，#P<0.05

表5 桑葉提取物對雙氯酚酸鈉在大鼠體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)參數(shù)的影響

注：與NS組比較，*P<0.05；與CMC組比較，#P<0.05

5 討論

隨著中藥及中藥制劑在醫(yī)療救治中的廣泛使用，由中藥-中藥、中藥-西藥聯(lián)合用藥引起CYP450酶的誘導(dǎo)/抑制，產(chǎn)生的藥物相互作用和不良反應(yīng)的事件明顯增加，受到臨床藥師和醫(yī)師的廣泛關(guān)注[10-16]。通過研究中藥對CYP450酶的調(diào)控作用可以預(yù)測中藥的某些臨床療效，揭示中藥之間及中西藥并用的相互作用，從而指導(dǎo)臨床合理用藥，避免藥物相互作用的發(fā)生，提高中藥使用的安全性和有效性[17-18]。因此，本研究希望通過初步探討桑葉不同提取物對大鼠體內(nèi)CYP450酶活性的影響來為后期臨床聯(lián)合給藥提供一定的參考意見。

本實(shí)驗(yàn)參考2015年版《中華人民共和國藥典》以確定桑葉不同提取物的給藥量[19]，最終桑葉不同提取物的給藥量為1 g/kg。由于中藥多為口服，故本實(shí)驗(yàn)給藥方式的選擇為灌胃給藥。本實(shí)驗(yàn)參照課題組前期研究并進(jìn)行驗(yàn)證[20-22]。與NS組相比，CMC組中各探針底物的主要藥物代謝動力學(xué)參數(shù)無顯著差異，表明可以用0.5% CMC-Na溶液溶解難溶性藥物用于研究藥物對CYP450酶活性的影響。

CYP1A2是CYP家族中與藥物代謝關(guān)系最為密切的亞酶，其可以代謝8%～10%的上市藥物[23-24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連續(xù)灌胃給予桑葉不同提取物14 d后，與NS組相比，AML組中非那西丁在大鼠體內(nèi)血藥濃度升高，代謝減慢，表明連續(xù)灌胃給藥AML對大鼠體內(nèi)CYP1A2可能存在一定的抑制作用，而連續(xù)灌胃給藥EML對大鼠體內(nèi)CYP2B1酶活性無顯著性影響。提示AML與其他通過CYP1A2酶代謝的藥物同時使用時可能需要調(diào)整劑量。另外，3種CYP1酶(CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1)都參與各種致癌物的代謝活化，它們的誘導(dǎo)可能對人類健康構(gòu)成嚴(yán)重危害[25]。因此，AML對其的抑制作用可能在癌癥預(yù)防中起重要作用。

CYP2B6在人體內(nèi)參與某些前致癌物和毒素物質(zhì)的激活而備受人們的關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連續(xù)灌胃給予AML對大鼠體內(nèi)CYP2B6酶活性無顯著性影響，而EML中安非他酮在大鼠體內(nèi)血藥濃度升高，代謝減慢，表明對大鼠體內(nèi)CYP2B6可能存在一定的抑制作用。說明AML可減少機(jī)體對前致癌物和前毒性物質(zhì)的代謝，對糖尿病狀態(tài)下的機(jī)體代謝可能起到一定的改善和保護(hù)作用。值得注意的是，與CMC相比，EML組中cmax增大了1.54倍，這意味著連續(xù)灌胃EML對大鼠CYP酶的活性產(chǎn)生了相當(dāng)大的影響。因此，EML與其他通過CYP2B6酶代謝的藥物聯(lián)合使用時需謹(jǐn)慎，應(yīng)及時調(diào)整給藥劑量并對其進(jìn)行監(jiān)測，避免藥物之間相互作用導(dǎo)致產(chǎn)生藥物不良反應(yīng)。

CYP2C是CYP450家族中具有代表性的重要酶類，占總肝CYP含量的1/5，參與臨床藥物代謝的約有16%。在這個家族中，CYP2C9參與了多種降糖藥(如格列本脲、甲苯磺丁脲和二甲雙胍)的代謝[26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，連續(xù)灌胃給予桑葉不同提取物14 d后，AML和EML組中雙氯芬酸鈉在大鼠體內(nèi)均存在血藥濃度升高，代謝減慢的現(xiàn)象，表明CYP2C6在給大鼠連續(xù)灌胃給藥AML和EML后存在一定的抑制作用。提示臨床上AML和EML與CYP2C9底物藥物聯(lián)用時，應(yīng)注意及時調(diào)整劑量，避免在用藥過程中引發(fā)藥物濃度過高所引起的毒性及不良反應(yīng)。

綜上所述，本研究探索藥物相互作用的方法和模型，適合初步篩選可能存在的藥物相互作用。當(dāng)桑葉提取物與CYP1A2，CYP2B6，CYP2C9酶代謝的藥物聯(lián)用時，應(yīng)密切關(guān)注臨床藥物-藥物的相互作用。