周利利，曾凡軍，涂珍珍，郭立鈺，郭思佳，鄧慶梅，周海勝,2

轉(zhuǎn)錄因子GRHL3作為Grainyhead家族成員之一，在胚胎發(fā)育過程中，參與調(diào)控上皮細(xì)胞的分化和遷移[1-2]。GRHL3基因敲除小鼠因神經(jīng)管閉合缺陷和皮膚表皮屏障缺少而致死[3-4]。對于GRHL3調(diào)控腫瘤細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲的靶基因，目前報(bào)道較少。分揀連接蛋白16(Sorting Nexin 16，SNX16)屬于SNXs蛋白家族成員，分布于胞外基質(zhì)連接的粘著斑。過去研究[5]顯示增加SNX16的表達(dá)能夠 抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，其機(jī)制是與SNX16調(diào)控E-cadherin的回收再利用有關(guān)。

為證實(shí)SNX16是GRHL3調(diào)控的靶基因并研究其對乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，擬利用免疫組織化學(xué)方法分析GRHL3和SNX16在乳腺癌組織中表達(dá)關(guān)系；利用低侵襲能力的乳腺癌細(xì)胞株MCF7，過量表達(dá)GRHL3后分析SNX16的表達(dá)變化及MCF7細(xì)胞遷移和侵襲變化，初步探討GRHL3調(diào)控SNX16表達(dá)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1組織標(biāo)本 人乳腺癌組織標(biāo)本由中國科學(xué)院合肥腫瘤醫(yī)院及達(dá)安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心病理科提供，其中乳腺侵襲性導(dǎo)管癌標(biāo)本18例，乳腺侵襲性導(dǎo)管癌癌旁組織標(biāo)本10例，正常乳腺組織標(biāo)本2例。

1.1.2細(xì)胞系 人乳腺癌細(xì)胞系MCF7和人胚胎腎細(xì)胞系293T由海勝實(shí)驗(yàn)室保存；穩(wěn)定過量表達(dá)GRHL3的MCF7細(xì)胞系由海勝實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.3載體 真核細(xì)胞表達(dá)載體pCMV-Tag-2B、用于檢測啟動(dòng)子活性的熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic、海腎螢光素酶報(bào)告基因載體pRL-TK載體購自美國Promega公司；克隆載體pMD-18T購自大連寶生物有限公司；過量表達(dá)GRHL3的表達(dá)載體pCMV-GRHL3、過量表達(dá)SNX16的表達(dá)載體pCMV-SNX16由海勝實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.4引物 用于PCR擴(kuò)增人的SNX16 基因啟動(dòng)子DNA引物：P1：5′-AGAGAATGTCGATTTCCTGCCA-3′，P2：5′-TTAACCGCAGCTTTTCGCCT- 3′；用于對GRHL3第一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(Site 1)進(jìn)行定點(diǎn)突變的PCR引物Prom1：5′-AGAGAATGTCGAcgacttCTGCCA-3′，用于對GRHL3第二個(gè)結(jié)合位點(diǎn)(Site 2)定點(diǎn)突變的PCR引物Prom2：5′-AGAGACTatctgattCGGGGAGCAGCTGCT-3′。Prom1和Prom2的序列中小寫字母為突變位點(diǎn)序列。

1.1.5主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基和青霉素/鏈霉素(P/S)來自美國Hyclon公司；胎牛血清(FBS)購自美國Corning公司；轉(zhuǎn)染細(xì)胞試劑Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司；兔源抗SNX16抗體購自美國Novus Biologicals公司，鼠源抗GAPDH抗體和辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的二抗購自美國Santa Cruz公司；免疫組化二抗和免疫組化DAB顯色劑試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；BD基質(zhì)膠和Boyden小室購于美國BD Biosciences公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MCF7細(xì)胞使用含10%胎牛血清和含1%的P/S的RPMI-1640培養(yǎng)基。細(xì)胞放置于37 ℃并含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2SNX16基因啟動(dòng)子克隆和定點(diǎn)突變 通過PCR克隆野生型的SNX16基因啟動(dòng)子-417 bp 到 +105 bp DNA片段，并插入pMD-18T載體測序。利用KpnI和XhoI雙酶切將SNX16啟動(dòng)子亞克隆到pGL3-Basic載體上，構(gòu)建pGL3-SNX16 Promoter-Luc重組載體；利用突變引物按如下條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94 ℃、2 min，98 ℃、10 s，60 ℃、30 s，68 ℃、3 min；用DpnI消化模板質(zhì)粒DNA。用T4多聚核苷酸激酶和DNA連接酶處理PCR產(chǎn)物，以進(jìn)行自身環(huán)化。環(huán)化DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌，提取單個(gè)細(xì)菌克隆的質(zhì)粒DNA進(jìn)行測序。

1.2.3熒光素酶實(shí)驗(yàn) 將pGL3-Basic載體、重組載體pGL3-SNX16 Promoter-Luc以及3種突變載體與pRL-TK和pCMV-GRHL3 重組載體(或pCMV-Tag-2B空載體)按照Lipofectamine 3000試劑說明書操作，共同轉(zhuǎn)染239T細(xì)胞，24 h后收集樣品進(jìn)行熒光素酶活性檢測。

1.2.4Western blot實(shí)驗(yàn) 根據(jù)文獻(xiàn)[6]方法，收集細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺-SDS電泳，待目的蛋白充分分離至不同位置后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，室溫封閉45 min，4 ℃過夜孵育一抗(1 ∶1 000)。HRP標(biāo)記的二抗 室溫孵育6～8 h，加入超敏底物溶液，暗室中顯影和定影，拍照。

1.2.5Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)將融化BD基質(zhì)膠加入Transwell小室上層，晾干，靜置過夜；細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)整為2.0×105/ml，取200 μl加至上室，下室加600 μl 5% FBS培養(yǎng)基；甲醇固定20 min，蘇木精染色10 min，洗滌，伊紅染色2 min，沖洗后擦去上層細(xì)胞，制片，計(jì)數(shù)。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)過程與細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)相同，但在小室上層不添加BD基質(zhì)膠。

1.2.6免疫組化 組織切片(4 μm)常規(guī)脫蠟入水后，微波熱修復(fù)抗原，使用3% H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶，山羊血清封閉，4 ℃孵育一抗(1 ∶100)過夜。第2天依次室溫孵育通用二抗工作液聚合物，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，最后組織經(jīng)脫水透明后烘干封片。

2 結(jié)果

2.1免疫組化檢測GRHL3、SNX16在乳腺癌組織表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，GRHL3主要在乳腺癌組織的細(xì)胞核表達(dá)，胞質(zhì)亦可見GRHL3染色；SNX16分布于正常乳腺組織導(dǎo)管上皮細(xì)胞質(zhì)，而乳腺癌組織SNX16表達(dá)水平較低或不表達(dá)(圖1)。18例癌組織標(biāo)本中，14例(77.8%)顯示GRHL3(+)、SNX16(-)，10例癌旁組織有8例顯示GRHL3(+)、SNX16(-)；只有2例(11.1%)癌組織標(biāo)本與正常乳腺組織均顯示為GRHL3(-)、SNX16(+)(表1)。

表1 GRHL3和SNX16在乳腺癌組織和

2.2MCF7細(xì)胞GRHL3和SNX16的表達(dá)變化為了在細(xì)胞水平證實(shí)GRHL3與SNX16的負(fù)調(diào)控作用，選擇低侵襲力的乳腺癌細(xì)胞株MCF7作為研究對象，建立穩(wěn)定過量表達(dá)GRHL3的乳腺癌細(xì)胞株。將pCMV-GRHL3及其對應(yīng)空載體pCMV-Tag-2B分別轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞。通過G418篩選分別獲得過量表達(dá)GRHL3的MCF7/GRHL3細(xì)胞克隆和對照組細(xì)胞克隆MCF7/空載體。Western blot檢測結(jié)果顯示：MCF7/GRHL3細(xì)胞GRHL3的表達(dá)較對照MCF7/空載體細(xì)胞顯著增加，而SNX16的表達(dá)明顯降低(圖2A)；與對照組MCF7/空載體細(xì)胞相比，MCF7/GRHL3細(xì)胞的GRHL3(P=0.022)和SNX16(P=0.002)的表達(dá)變化均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2B)?？梢?，GRHL3和SNX16的表達(dá)變化與乳腺癌組織表達(dá)變化一致。

圖1 IHC檢測乳腺組織中GRHL3和SNX16表達(dá) ×200

2.3GRHL3抑制SNX16基因啟動(dòng)子活性分析已知GRHL3與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域DNA特異序列TTTCC(T)或GGCT(A)GAGG結(jié)合(圖3A)，抑制靶基因表達(dá)。通過生物信息學(xué)分析SNX16基因啟動(dòng)子DNA, 發(fā)現(xiàn)SNX16基因啟動(dòng)子區(qū)有2個(gè)GRHL3潛在結(jié)合位點(diǎn)：一號位點(diǎn)(Site 1)-408～-403 bp存在TTTCC(T)；二號位點(diǎn)(Site 2)+16 ～+23 bp存在GGCT(A)GAGG(圖3B)。利用MCF7細(xì)胞基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得SNX16基因啟動(dòng)子DNA(513 bp)，并亞克隆至pGL3-Basic，構(gòu)建重組載體pGL3-SNX16 Promoter-Luc；利用PCR方法對一號位點(diǎn)和二號位點(diǎn)分別或同時(shí)進(jìn)行定點(diǎn)突變。測序結(jié)果證實(shí)成功構(gòu)建重組載體pGL3-SNX16 Promoter-Luc并實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變(圖3C)。從而構(gòu)建含有3種突變的SNX16啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因的重組載體：一號位點(diǎn)突變的pGL3-SNX16 Promoter-Luc/m1、二號位點(diǎn)突變的pGL3-SNX16 Promoter-Luc/m2和兩位點(diǎn)突變pGL3-SNX16 Promoter-Luc/m1+2。

為了探討GRHL3對SNX16基因啟動(dòng)子的調(diào)控作用，將pGL3-SNX16 Promoter-Luc重組載體及3個(gè)突變的載體，聯(lián)合pRL-TK分別與pCMV-GRHL3(或pCMV-Tag-2B)共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。24 h后檢測各組相對熒光強(qiáng)度。結(jié)果顯示：GRHL3對野生型SNX16基因啟動(dòng)子有明顯的抑制作用(F=78.43，P=0.001)；一號位點(diǎn)(F=17.13，P=0.014)、二號位點(diǎn)(F=73.34，P=0.001)單突變的SNX16基因啟動(dòng)子在GRHL3作用下，仍然具有明顯抑制作用；當(dāng)一號位點(diǎn)與二號位點(diǎn)同時(shí)突變后，GRHL3沒有顯示SNX16基因啟動(dòng)子的抑制作用，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.09，P=0.153)(圖4)。

圖2 MCF7細(xì)胞過量表達(dá)GRHL3抑制SNX16表達(dá)

圖3 GRHL3結(jié)合DNA序列分析和SNX16基因啟動(dòng)子GRHL3結(jié)合位點(diǎn)突變

2.4GRHL3對細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響為了研究過量表達(dá)GRHL3抑制SNX16表達(dá)可能影響乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力，通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pCMV-SNX16以回補(bǔ)SNX16的表達(dá)，進(jìn)而進(jìn)行Transwell細(xì)胞遷移和細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。建立轉(zhuǎn)染空表達(dá)載體的細(xì)胞系MCF7/空載體；轉(zhuǎn)染過量表達(dá)GRHL3的細(xì)胞系MCF7/GRHL3；共轉(zhuǎn)染過量表達(dá)GRHL3和SNX16的細(xì)胞MCF7/GRHL3+SNX16。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染空載體MCF7細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)為(13.3±2.07)，GRHL3過表達(dá)MCF7細(xì)胞的遷移細(xì)胞均數(shù)(93.17±9.56)，MCF7/GRHL3細(xì)胞在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pCMV-SNX16以回補(bǔ)SNX16的表達(dá)，發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)為(20.50±4.18)。經(jīng)單因素方差分析三組間遷移能力,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。轉(zhuǎn)染空載體的MCF7對照細(xì)胞與回補(bǔ)SNX16表達(dá)的MCF7/GRHL3細(xì)胞相比，遷移細(xì)胞數(shù)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.184)(圖5)。

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染空載體的MCF7細(xì)胞發(fā)生侵襲細(xì)胞數(shù)為(10.83±1.72)，過表達(dá)GRHL3的MCF7細(xì)胞發(fā)生侵襲細(xì)胞數(shù)為(31.67±4.37)，過量表達(dá)GRHL3的MCF7/GRHL3細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCMV-SNX16后，發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)為(5.50±2.26)。經(jīng)單因素方差分析三組間侵襲能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。其中過量表達(dá)GRHL3的MCF7細(xì)胞遷移能力最強(qiáng)，轉(zhuǎn)染空載體的MCF7細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)明顯低于與過量表達(dá)GRHL3并回補(bǔ)SNX16的MCF7細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023)(圖5)。根據(jù)Transwell的遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)，說明GRHL3過量表達(dá)促進(jìn)MCF7細(xì)胞遷移和侵襲，且與GRHL3抑制SNX16表達(dá)有關(guān)。

圖4 GRHL3調(diào)節(jié)SNX16基因啟動(dòng)子活性分析

圖5 MCF7細(xì)胞遷移和侵襲

3 討論

Grainyhead 家族高度保守，所編碼的轉(zhuǎn)錄因子在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。GRHL3是其中的成員之一[1]。在小鼠發(fā)育過程中，GRHL3在傷口愈合、表皮形成及胚胎神經(jīng)管閉合等過程中發(fā)揮重要作用[1-3]。GRHL3不僅在正常生長發(fā)育過程發(fā)揮重要作用，同時(shí)參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。既往研究[7-8]表明，在早期乳腺癌中，尤其是非三陰乳腺癌中，GRHL3表達(dá)量升高，其機(jī)制是細(xì)胞對稱分裂和腫塊形成之間存在密切聯(lián)系。在果蠅和小鼠體內(nèi)，GRHL3調(diào)控多種參與表皮屏障形成及終末分化的基因表達(dá)[9]，近期研究[10]報(bào)道，敲除小鼠體內(nèi)角質(zhì)層形成細(xì)胞中GRHL3，可能誘發(fā)皮膚鱗癌的形成；基因表達(dá)譜分析顯示GRHL3的表達(dá)與E-cadherin表達(dá)有抑制作用[11]；GRHL3通過直接或間接結(jié)合E-cadherin啟動(dòng)子上，抑制E-cadherin的表達(dá)，促進(jìn)上皮來源腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[11]。

為了探尋GRHL3調(diào)控與細(xì)胞遷移和侵襲的相關(guān)基因的表達(dá)，前期的染色質(zhì)免疫共沉淀測序的結(jié)果發(fā)現(xiàn)SNX16可能是GRHL3調(diào)控的潛在靶基因(結(jié)果未示)。乳腺癌組織的免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，GRHL3高表達(dá)的腫瘤組織中SNX16的表達(dá)明顯降低；提示SNX16可能受到GRHL3的負(fù)調(diào)控。細(xì)胞水平研究進(jìn)一步證實(shí)過量表達(dá)GRHL3時(shí)，SNX16的表達(dá)水平顯著降低。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SNX16基因啟動(dòng)子DNA序列存在GRHL3的潛在結(jié)合位點(diǎn)TTTCC(T)或GGCT(A)GAGG，與前期研究[5]發(fā)現(xiàn)的GRHL3結(jié)合E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列5′-CACCTG-3′或5′-CAGGTG-3′均具有高度相似性。通過克隆SNX16基因啟動(dòng)子進(jìn)行雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)，結(jié)果證實(shí)GRHL3對SNX16基因啟動(dòng)子的活性同樣具有抑制作用，與GRHL3結(jié)合E-cadherin基因啟動(dòng)子抑制靶基因表達(dá)具有一致性。當(dāng)對SNX16基因啟動(dòng)子區(qū)的GRHL3潛在結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，發(fā)現(xiàn)GRHL3無顯著的抑制作用。因此GRHL3可能直接或間接通過結(jié)合于SNX16基因啟動(dòng)子，抑制SNX16表達(dá)。

以往研究[11]證實(shí)GRHL3過量表達(dá)可以抑制E-cadherin基因表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲；SNX16的過量表達(dá)可以促進(jìn)E-cadherin的回收再利用，而抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[6-9]。在低侵襲力乳腺癌細(xì)胞MCF7中過量表達(dá)GRHL3，可以顯著增加細(xì)胞的遷移和侵襲能力；當(dāng)在過量表達(dá)GRHL3的細(xì)胞中轉(zhuǎn)染SNX16 cDNA表達(dá)載體時(shí)，細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降低。因此，GRHL3既能抑制E-cadherin的表達(dá)又能抑制SNX16的表達(dá)，進(jìn)而影響細(xì)胞遷移和侵襲。GRHL3作為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控細(xì)胞遷移和侵襲的靶基因表達(dá)，進(jìn)而改變細(xì)胞的遷移和侵襲能力。除了已經(jīng)鑒定的GRHL3調(diào)控的靶基因SNX16和E-cadherin外，可能還參與調(diào)控其他靶基因的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)和鑒定GRHL3調(diào)控的靶基因及其信號通路，從而探討GRHL3在腫瘤細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的核心轉(zhuǎn)錄因子SNAIL、ZEB1和TWIST等發(fā)生相互作用的方式[12]，為揭示GRHL3在腫瘤的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有重要的理論意義，也為干預(yù)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲尋找新的治療靶點(diǎn)具有應(yīng)用價(jià)值。