馮 濤, 鄔玲玲
(杭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院,浙江 杭州 310018)
氟喹諾酮(Fluoroquinolones,FQs)是一種人工合成的抗菌類藥物,具有抗菌作用強(qiáng)、抗菌性廣等特點(diǎn),目前被養(yǎng)殖戶廣泛應(yīng)用。我國于20世紀(jì)70年代開始將環(huán)丙沙星、恩諾沙星、達(dá)氟沙星、沙拉沙星等喹諾酮類藥物應(yīng)用于水產(chǎn)病害防治。隨著FQs的廣泛應(yīng)用,在水產(chǎn)品體內(nèi)藥物殘留情況越來越嚴(yán)重,也將對(duì)人類造成極大的危害。因此,人們對(duì)FQs的藥物殘留檢測(cè)研究越來越重視。世界各國已將氟喹諾酮列為動(dòng)物性食品中殘留檢測(cè)的重點(diǎn)監(jiān)控藥物,對(duì)水產(chǎn)品體內(nèi)的氟喹諾酮?dú)埩粲袊?yán)格的標(biāo)準(zhǔn)和要求[1-3]。
目前測(cè)定氟喹諾酮藥物殘留方法包括毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法等。本研究采用固相萃取技術(shù)進(jìn)行水產(chǎn)品富集等前處理,用熒光檢測(cè)器的液相色譜儀梯度洗脫檢測(cè),測(cè)定人工養(yǎng)殖水產(chǎn)品中氟喹諾酮?dú)埩鬧4-5]。
Waters e2695高效液相色譜儀,美國Waters公司;Waters2475熒光檢測(cè)器,美國Waters公司;明澈-D型超純水器,美國Millipore公司;YGC-6A固相萃取儀,鄭州寶晶電子科技有限公司;KQ3200E型超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;HLB固相萃取柱,6 cc/500 mg,美國waters公司;HSC-24B氮吹儀,恒奧科技有限公司;離心機(jī),湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司;渦旋振蕩器,ABSON Vortex Mixer。
甲醇、乙腈,色譜級(jí),美國TEDIA公司;氟喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)品:環(huán)丙沙星、恩諾沙星、達(dá)氟沙星、沙拉沙星,美國CATO公司。
稱取5.00(±0.01)g對(duì)蝦肉、大閘蟹肉、黑魚肉置于50 mL離心管中,加入甲酸(1%甲酸)-乙腈溶液10 mL,渦旋振蕩1 min,超聲提取20 min后,4 000 r/min離心10 min,取上清液于另一干凈離心管中。殘留組織重復(fù)操作提取,合并上清液。將HLB固相萃取柱用3 mL甲醇、3 mL水活化,取10 mL提取液上清樣后,用3 mL甲醇洗脫,氮吹至凈干,用乙腈定容至1 mL,用0.22 μm濾膜過濾,取0.5 mL加入1 mL 20×10-9的混合標(biāo)準(zhǔn)液。
采用C18(5 μm,4.6×250 nm)色譜柱,流速:0.6 mL/min,柱溫為35 ℃,進(jìn)樣量為10 μL,熒光檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng):激發(fā)波長(zhǎng)280 nm,發(fā)射波長(zhǎng)450 nm,以乙腈和0.02%的甲酸水溶液(pH=3.0)作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,洗脫方法見第34頁表1。
表1 流動(dòng)相洗脫方法
由圖1可見,4種分析物的保留時(shí)間分別為:環(huán)丙沙星26.304 min;達(dá)氟沙星28.228 min;恩諾沙星29.822 min;沙拉沙星35.054 min。
圖1 4種FQs的FLD檢測(cè)HPLC色譜圖
環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星等氟喹諾酮類藥物結(jié)構(gòu)式中含有羧基和哌嗪基,故運(yùn)用反相色譜分析時(shí),選擇酸性溶液為流動(dòng)相。流動(dòng)相中pH值對(duì)檢測(cè)氟喹諾酮類藥物的分離度影響很大。在不同pH的條件下進(jìn)行測(cè)試,實(shí)驗(yàn)表明,流動(dòng)相的pH值越低,F(xiàn)Qs的保留時(shí)間越長(zhǎng)。本方法采用pH=3.0的甲酸水溶液(0.02%)和乙腈作為流動(dòng)相,不僅能使4種氟喹諾酮類藥物有很好的分離度,而且靈敏度高。4種氟喹諾酮環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星熒光檢測(cè)波長(zhǎng)較為接近,采用280 nm的激發(fā)波長(zhǎng)和450 nm的發(fā)射波長(zhǎng)。
取質(zhì)量濃度分別為0.0、5.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 μg/L系列標(biāo)準(zhǔn)樣品,按實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定,得到不同濃度的色譜圖,按照上述方法,每個(gè)濃度平均測(cè)定7次,并求取平均值,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程等參數(shù)見表2。
表2 目標(biāo)物回歸方程和相關(guān)系數(shù)
在空白對(duì)蝦肉、大閘蟹肉、黑魚肉中添加1 mL的10×10-9、30×10-9、50×10-9的標(biāo)準(zhǔn)樣品,按照1.2樣品處理方法進(jìn)行處理,在1.3HPLC分析條件下進(jìn)行測(cè)定,求得各喹諾酮的回收量和回收率如表3所示。
表3 方法加標(biāo)回收率
測(cè)得4種FQs在對(duì)蝦肉、大閘蟹肉、黑魚肉中的平均回收率分別為79.5%~99.6%、76.8%~101.4%、77.9%~103.2%。滿足樣品分析質(zhì)量控制要求。
對(duì)取自杭州某市場(chǎng)中對(duì)蝦、大閘蟹、黑魚各10份樣品進(jìn)行分析檢測(cè)。根據(jù)色譜條件,以保留時(shí)間定性,峰面積定量,樣品加標(biāo)經(jīng)FLD檢測(cè),其中2份對(duì)蝦(DX19003、DX19007)、1份大閘蟹(ZX19006)和2份黑魚(HY19003、HY19009)中檢測(cè)到氟喹諾酮類藥物殘留。分析結(jié)果見表4。
表4 樣品檢測(cè)FQs藥物殘留 (μg/L)
1) 建立了FLD梯度洗脫的HPLC法檢測(cè)水產(chǎn)品中的FQs,優(yōu)化了色譜條件。該方法滿足人工養(yǎng)殖水產(chǎn)品中的FQs檢測(cè)要求。4種FQs經(jīng)過柱濃縮回收,回收率均在76.8%~103.2%,分析方法準(zhǔn)確可靠。
2) 采集杭州某市場(chǎng)中對(duì)蝦、大閘蟹、黑魚各10份樣品,進(jìn)行定量分析。結(jié)果顯示,個(gè)別樣品中檢測(cè)到氟喹諾酮類藥物殘留。