陳冬玲 王 倩 李 忠

(南陽理工學院張仲景國醫(yī)國藥學院，南陽473004)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。2017年在美國和歐盟的女性中乳腺癌的病死率位居前兩位，死亡人數(shù)將分別達到40 610例和92 600例[1,2]。在圍手術(shù)期進行化療是治療乳腺癌的重要輔助手段，有助于提高治療效果，但耐藥性的產(chǎn)生是其療效下降的重要原因[3]。腫瘤免疫治療是一種新興的腫瘤治療模式，其中自然殺傷(Natural killer,NK)細胞的作用越來越受到重視。因此如何增強腫瘤細胞對NK細胞殺傷的敏感性成為目前研究的熱點之一?？鄥⑹嵌箍浦参锟鄥⒌母稍锔?，主要活性成分為苦參堿(Matrine,MT)和氧化苦參堿(Oxymatrine,OMT)。近年來的研究顯示，OMT可通過誘導凋亡、抑制增殖、阻礙侵襲和轉(zhuǎn)移及提高化療藥物敏感性發(fā)揮抗腫瘤活性[4-9]。但關(guān)于OMT能否提高乳腺癌細胞對NK細胞殺傷作用的敏感性目前尚未見報道。因此本研究旨在體外觀察OMT處理前后MCF-7細胞對NK-92MI細胞敏感性的變化，并探討其可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 OMT購自中國藥品生物制品檢定所；MCF-7細胞和NK-92MI購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；人乳腺癌阿霉素耐藥株由本校醫(yī)學實驗中心提供；胎牛血清、馬血清、DMEM培養(yǎng)基和α-MEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代甲酸銨(PDTC)購自Sigma公司；CCK-8試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒、AnnexinV-FITC凋亡檢測試劑、人TNF-α和IFN-γ ELISA試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；藻紅蛋白(PE)標記的小鼠抗人ULBP1、ULBP2、和MICA/B單克隆抗體以及IgG2a同型對照抗體購自eBioscience公司；兔抗人p-p65(Ser536)、p65和β-actin抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG購自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) NK-92MI細胞用含12.5%胎牛血清和12.5%馬血清的α-MEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)；MCF-7細胞用含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.2.2CCK-8法檢測細胞活力 將MCF-7細胞和NK-92MI細胞以每孔5 000個接種于96孔板，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。棄上清，加入100 μl 含有不同濃度OMT的細胞培養(yǎng)液，終濃度分別為1.25、2.5、5、10、20和40 μmol/L，每個濃度設(shè)5個復孔，同時設(shè)調(diào)零孔和對照組，在37℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)24、48和72 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃孵育1 h，用酶標儀檢測各孔于450 nm波長處的吸光度A值。細胞活力=藥物組A值/對照組A值×100%。采用SPSS16.0軟件Probit回歸模型計算OMT對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度(Half maximal inhibitory concentration,IC50)。

1.2.3LDH法檢測NK-92MI細胞殺傷活性 將MCF-7細胞以每孔5 000個接種于96孔板，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。去上清，加入100 μl含有OMT(終濃度分別為1.25、2.5、5 μmol/L)的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，去上清，按5∶1、10∶1 和20∶1 的效靶比(E∶T)分別加入NK-92MI細胞，同時設(shè)MCF-7細胞對照組、NK-92MI細胞對照組和MCF-7細胞最大釋放對照組，每組設(shè)5個復孔。培養(yǎng)24 h后，400 g 離心5 min，每孔取上清液100 μl轉(zhuǎn)移至一新的96 孔板中，每孔取加入50 μl LDH檢測工作液，室溫避光孵育30 min，用酶標儀檢測各孔490 nm波長處的吸光度A值。殺傷率(%)=(實驗組A值-靶細胞對照組A值-NK-92MI細胞對照組A值)/(靶細胞最大釋放對照組A值-靶細胞對照組A值)×100%。實驗重復3次。

1.2.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 將MCF-7細胞以每孔105個接種于6孔板，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過夜。去上清，加入2 ml含有不同濃度OMT(0、1.25、2.5、5 μmol/L)的細胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，去上清，按5∶1效靶比加入NK-92MI細胞，每組設(shè)5個復孔。培養(yǎng)24 h后，棄上清，收集各孔貼壁細胞，PBS洗滌2次，重懸于400 μl Annexin V-FITC結(jié)合液中。先加入5 μl AnnexinV-FITC，4℃避光孵育15 min，再加入10 μl碘化丙啶染色液，4℃避光孵育15 min。使用流式細胞儀分析檢測細胞凋亡。實驗重復3次。

1.2.5Western blot法檢測p65的磷酸化 MCF-7細胞分別經(jīng)5 μmol/L OMT和/或10 μmol/L PDTC處理24 h，同時設(shè)無藥對照組。用RIPA裂解各組細胞提取總蛋白，用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)濃度，取25 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用封閉液(5% BSA/TBST)封閉1 h，加入一抗(p-p65和p65抗體以1∶1 000稀釋，β-actin抗體以1∶2 000稀釋)，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，加入二抗(1∶2 000稀釋)室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL進行發(fā)光反應(yīng)，暗室X膠片顯影，拍照，使用Image J 1.45s軟件進行灰度分析。以目標蛋白與內(nèi)參β-actin灰度值的灰度比值作為目標蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。

1.2.6流式細胞術(shù)檢測MCF-7細胞表面ULBP2、MICA/B和Fas表達 MCF-7細胞分別經(jīng)5 μmol/L OMT和/或10 μmol/L PDTC處理24 h，同時設(shè)無藥對照組。收集各組細胞，PBS 洗滌2次，加入PE標記的ULBP2、MICA/B、Fas或同型IgG2a抗體，4℃避光孵育30 min，PBS洗滌2次，送流式細胞儀檢測平均熒光強度(Mean fluorescence intensity,MFI)，相對熒光強度=(藥物組MFI-同型對照MFI)/(對照組MFI-同型對照MFI)。實驗重復3次。

1.2.7ELISA檢測TNF-α和IFN-γ的分泌 將MCF-7細胞以每孔5 000個接種于96孔板，分別加入5 μmol/L OMT和/或10 μmol/L PDTC，同時設(shè)無藥MCF-7細胞組和無細胞對照組，每組設(shè)5個復孔。培養(yǎng)24 h后，去上清，按5∶1的效靶比向各孔加入NK-92MI細胞懸液。培養(yǎng)24 h后，400 g 離心5 min，每孔取上清液100 μl轉(zhuǎn)移至一新的96孔板中，采用ELISA雙抗體夾心法檢測各孔上清液中TNF-α和IFN-γ的含量，先繪制標準曲線，建立標準曲線方程，然后用酶標儀檢測各樣品孔450 nm波長處的吸光度A值，并計算出樣品中TNF-α和IFN-γ的含量(pg/ml)。實驗重復3次。

2 結(jié)果

2.1OMT抑制MCF-7細胞活力 如圖1所示，隨著OMT濃度和作用時間的增加，MCF-7細胞活力顯著降低。OMT作用MCF-7細胞24、48和72 h的IC50分別為44.53、20.87和12.94 μmol/L。這表明OMT對乳腺癌MCF-7細胞具有顯著的抑制作用，且呈劑量和時間依賴性。

2.2OMT增強MCF-7細胞對NK-92MI細胞殺傷作用的敏感性 如圖2所示，與未經(jīng)OMT處理的MCF-7細胞相比，1.25 μmol/L OMT處理MCF-7細胞24 h后，在不同效靶比下NK-92MI細胞對其殺傷率并未發(fā)生明顯變化；2.5或5 μmol/L OMT處理MCF-7細胞24 h后，在不同效靶比下NK-92MI細胞對其殺傷率顯著升高(P<0.05)。

2.3NK-92MI細胞促進OMT預處理MCF-7細胞凋亡 如圖3所示，在效靶比為5∶1 時，與未經(jīng)OMT處理的MCF-7細胞相比，1.25 μmol/L OMT處理MCF-7細胞24 h后， NK-92MI細胞誘導的MCF-7細胞凋亡率無明顯變化；而2.5或5 μmol/L OMT處理MCF-7細胞24 h后，NK-92MI細胞誘導的MCF-7細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

圖1 OMT對MCF-7細胞活力的影響Fig.1 Effect of OMT on cell viability in MCF-7 cellsNote: *.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus 10 μmol/L group;△.P<0.05 versus 20 μmol/L group.

2.4OMT上調(diào)MCF-7細胞p65的磷酸化水平 如圖4所示，與未經(jīng)藥物處理的MCF-7細胞相比，5 μmol/L OMT處理MCF-7細胞24 h后，p65的磷酸化水平顯著升高(P<0.05)，而10 μmol/L PDTC處理MCF-7細胞24 h后，p65的磷酸化水平顯著降低(P<0.05)；同時，OMT+PDTC組p65的磷酸化水平明顯低于OMT組(P<0.05)。這提示OMT可激活MCF-7細胞的RelA/p65途徑，且可被NF-κB抑制劑PDTC部分阻斷。

圖2 不同效靶比下NK-92MI細胞對MCF-7細胞的殺傷作用Fig.2 Cytotoxicity of NK-92MI cells against MCF-7 cells at different E∶T ratioNote: *.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus 2.5 μmol/L group.

圖3 NK-92MI細胞誘導MCF-7細胞凋亡Fig.3 NK-92MI cell-induced apoptosis of MCF-7 cellsNote: A.Scatter diagram of flow cytometry;B.Statistical analysis of the apoptosis rate(Q2+Q4).*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus 2.5 μmol/L group.

圖4 MCF-7細胞中p65蛋白的磷酸化水平Fig.4 Phosphorylation of p65 in MCF-7 cellsNote: A.Western blot assay;B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus OMT group.

圖5 MCF-7細胞表面ULBP1、ULBP2和MICA/B蛋白的表達Fig.5 Expression of ULBP1,ULBP2 and MICA/B at surface in MCF-7 cellsNote: A.Flow cytometry assay;B.Statistical analysis.*.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus OMT group.

2.5OMT上調(diào)MCF-7細胞表面ULBP1、ULBP2和MICA/B蛋白的表達 如圖5所示，與未經(jīng)藥物處理的MCF-7細胞相比，經(jīng)5 μmol/L OMT處理24 h的MCF-7細胞，其表面ULBP1、ULBP2和MICA/B蛋白的相對熒光強度顯著升高(P<0.05)；而經(jīng)10 μmol/L PDTC處理24 h的MCF-7細胞，其表面ULBP1、ULBP2和MICA/B蛋白的相對熒光強度顯著降低(P<0.05)；此外，與OMT組相比，OMT+PDTC組MCF-7細胞表面ULBP1、ULBP2和MICA/B蛋白的相對熒光強度顯著降低(P<0.05)。這表明OMT可能通過NF-κB信號通路上調(diào)MCF-7細胞表面ULBP1、ULBP2和MICA/B蛋白的表達。

圖6 NK-92MI細胞TNF-α和IFN-γ的分泌Fig.6 Secretion of TNF-α and IFN-γ from NK cellsNote: *.P<0.05 versus control group;#.P<0.05 versus MCF-7 group;△.P<0.05 versus OMT+MCF-7 group.

2.6OMT促進TNF-α和IFN-γ的分泌 如圖6所示，與NK-92MI對照組相比，MCF-7+NK-92MI組上清液中的TNF-α和IFN-γ含量顯著升高(P<0.05)；與MCF-7+NK-92MI組相比，OMT+MCF-7+NK-92MI組上清液中的TNF-α和IFN-γ含量更高(P<0.05)，而PDTC+MCF-7+NK-92MI組上清液中的TNF-α和IFN-γ含量明顯降低(P<0.05)；此外，OMT+PCTC+MCF-7+NK-92MI組上清液中的TNF-α和IFN-γ含量低于OMT+MCF-7+NK-92MI組(P<0.05)。這提示OMT處理后的MCF-7細胞可促進NK-92MI細胞分泌更多的TNF-α和IFN-γ，該效應(yīng)可能與OMT激活NF-κB信號通路有關(guān)。

3 討論

NK細胞是機體固有免疫系統(tǒng)的主要細胞，不需要特異性抗原的刺激就可以殺傷靶細胞，因此NK細胞在抵御腫瘤，尤其在清除轉(zhuǎn)移瘤細胞和微小腫瘤病灶中發(fā)揮著重要作用[10,11]。NK-92是一株IL-2依賴型NK細胞株，本研究所采用的NK-92MI細胞是NK-92細胞轉(zhuǎn)染人IL-2 cDNA得到的IL-2非依賴的NK細胞株。本研究發(fā)現(xiàn)，OMT可在體外顯著抑制人乳腺癌MCF-7細胞活力，并具有時間和劑量依賴性。為避免OMT的毒性作用對后續(xù)實驗的干擾，本研究選取毒性作用不明顯的低濃度OMT(1.25、2.5、5 μmol/L)處理MCF-7細胞24 h，以進一步觀察低濃度OMT作用前后MCF-7細胞對NK-92MI細胞殺傷敏感性的變化。LDH試驗和流式細胞術(shù)結(jié)果表明，NK-92MI細胞對低濃度OMT處理后的乳腺癌MCF-7細胞的殺傷作用顯著增強，并呈劑量依賴性。

NKG2D是NKG2家族的成員，為Ⅱ型C-凝集素樣受體，在NK細胞、CD8+T細胞、NKT細胞和γδT細胞表面都有表達，是一個重要的激活性受體[12]。NKG2D的配體主要有兩類：一類是MHC-Ⅰ類鏈相關(guān)的A/B分子(MHC class Ⅰ chain-relatedmolecules A/B,MICA/B)，另一類配體是UL16 結(jié)合蛋白(UL16-binding proteins,ULBPs)。NKG2D配體在大多數(shù)上皮源性腫瘤細胞表面表達，如卵巢癌、結(jié)腸癌、白血病等，但在正常細胞表面極少表達[13]。當腫瘤細胞表面的NKG2D配體與NK細胞表面的NKG2D結(jié)合后可直接激活NK細胞，從而發(fā)揮對腫瘤細胞的殺傷作用[14]。Feng等[15]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細胞表面ULBP1、ULBP2和MICA蛋白的表達水平升高后，NK細胞對其殺傷活性顯著增強。

Chen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，NF-κB和MICA在垂體腺瘤組織中呈高表達，且二者呈正相關(guān)。Huang等[17]研究發(fā)現(xiàn)，采用siRNA沉默NF-κB基因可下調(diào)鼻咽癌順鉑耐藥株CNE2/DDP細胞和肝癌HepG2細胞中MICA/B和ULBP1-3蛋白的表達水平。Zhu等[18]研究證實，抑制NF-κB信號通路可阻斷足葉乙甙上調(diào)MCF-7細胞中MICA/B的mRNA和蛋白表達水平。上述研究表明，NF-κB信號通路與腫瘤細胞中NKG2D配體的表達水平密切相關(guān)。NF-κB是由p50和RelA/p65組成的異二聚體，因RelA/p65含有轉(zhuǎn)錄激活域(Transcriptional activation domain,TAD)，能夠激活靶基因轉(zhuǎn)錄，成為NF-κB最重要的功能亞基。Ser536位于RelA/p65的TAD內(nèi)，該位點磷酸化可增強其轉(zhuǎn)錄活性。

本研究發(fā)現(xiàn)，OMT可上調(diào)MCF-7細胞表面ULBP1、ULBP2和MICA/B蛋白的表達水平，并上調(diào)RelA/p65在Ser536處的磷酸化水平，但該作用可被NF-κB抑制劑PDTC抑制。同時PDTC還可下調(diào)MCF-7細胞ULBP1、ULBP2和MICA/B蛋白表達以及RelA/p65在Ser536處的磷酸化水平。這提示OMT可能通過激活NF-κB通路上調(diào)MCF-7細胞表面ULBP1、ULBP2和MICA/B蛋白的表達。

IFN-γ可抑制腫瘤細胞增殖、侵襲和誘導腫瘤細胞凋亡、增加腫瘤細胞表面NKG2D配體和Fas的表達及抗腫瘤血管生成等[19-23]。IFN-γ可通過上調(diào)Fas蛋白表達增強FasL誘導的MCF-7細胞凋亡[22]。TNF-α和IFN-γ聯(lián)用可導致MCF-7細胞發(fā)生S期阻滯和細胞凋亡[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)OMT預處理的MCF-7細胞可誘導NK-92MI細胞分泌大量TNF-α和IFN-γ，這可能是OMT加劇由NK-92MI細胞誘導的MCF-7細胞凋亡的機制之一。同時NF-κB抑制劑PDTC可抑制該效應(yīng)，提示這可能與OMT激活NF-κB信號通路有關(guān)。

綜上所述，在體外OMT可增強MCF-7細胞對NK-92MI細胞殺傷作用的敏感性，這可能與其激活NF-κB信號通路，進而上調(diào)MCF-7細胞表面ULBP1、ULBP2和MICA/B蛋白表達及促進NK-92MI細胞分泌TNF-α和IFN-γ有關(guān)。