方超， 張劍南， 李梟虓， 陳軍安， 李娟， 王亞軍

(四川大學生命科學學院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，成都610065)

人Homosapiens的G蛋白偶聯(lián)受體15(G protein-coupling receptor 15，GPR15)于1996年被首次克隆(Heiberetal.，1996)，研究表明GPR15在哺乳動物中調(diào)節(jié)多種生理功能：在小鼠Musmusculus大腸T細胞中，GPR15通過介導上皮中T細胞歸巢調(diào)節(jié)免疫反應，參與調(diào)控調(diào)節(jié)性T細胞(Treg cells)抑制非感染性炎癥，對預防大腸病理性炎癥至關重要(Kimetal.，2013；Nguyenetal.，2015)；在小鼠皮膚淋巴細胞歸巢中，GPR15有助于淋巴細胞靶向不同的上皮部位(Lahletal.，2014)；GPR15還參與先天性免疫調(diào)節(jié)，并與多種疾病存在密切關聯(lián)，如克羅恩病和類風濕性關節(jié)炎(Cartwrightetal.，2014)；GPR15在吸煙者體內(nèi)高表達亦暗示其可能參與調(diào)控吸煙引起的疾病(Koks & Koks， 2017)。除了炎癥反應之外，腸道微生物菌群可以影響小鼠GPR15的表達水平，暗示GPR15可能參與調(diào)控腸道的微生物菌群穩(wěn)態(tài)平衡(Kimetal.，2013)。GPR15調(diào)節(jié)的生理功能與其在組織中的特異性表達圖譜密切相關，人類組織轉錄組測序數(shù)據(jù)表明GPR15在淋巴細胞中具有最高的表達豐度，表明其在免疫反應中的重要作用，其次高表達于結腸和小腸中，表明GPR15可參與調(diào)節(jié)腸道穩(wěn)態(tài)(Koks & Koks，2017)。

因為GPR15是孤兒受體，故人們致力于尋找其內(nèi)源性配體。最新研究報道人類C10ORF99基因編碼GPR15的內(nèi)源性配體蛋白GPR15L，可以激活GPR15并抑制毛喉素(forskolin)誘導的環(huán)腺苷酸(cAMP)產(chǎn)生(Suplyetal.，2017)。Ocon等(2017)的研究表明人類C10ORF99基因和小鼠2610528A11Rik基因可編碼GPR15L，并鑒定其可作為一種淋巴細胞趨化因子，通過激活GPR15發(fā)揮功能。但我們發(fā)現(xiàn)GPR15L基因在非哺乳類脊椎動物中消失，因此，在鳥類等非哺乳動物類群中，GPR15的配體仍待鑒定。因GPR15與愛帕琳肽受體(APLNR)和GPR25具有較高的結構相似性(Leeetal.，2001)，提示APLNR (Chngetal.，2013；Paulietal.，2014)和GPR25 (Zhangetal.，2018)的配體Apelin和Apela也可能會作為GPR15的潛在配體，但該假設有待驗證。

目前，關于GPR15的研究主要集中在哺乳動物中，在其他脊椎動物類群中的研究幾屬空白。鑒于GPR15在哺乳動物炎癥反應和腸道穩(wěn)態(tài)中的重要調(diào)控作用(Kimetal.，2013；Koks & Koks，2017)，本研究以家雞Gallusgallusdomesticus為模型，首次針對GPR15的基因結構、功能和表達特征進行了探究，以期為探究GPR15在非哺乳類脊椎動物中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅曼粉蛋雞購于成都牧星種雞場，本實驗室提供大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞。真核表達載體pcDNA3.1(+)購于美國Invitrogen公司，斑馬魚DaniorerioGPR25真核表達質(zhì)粒保存于本實驗室(Zhangetal.，2018)。RNAzol購于美國Molecular Research Center公司；限制性內(nèi)切酶、RNA反轉錄酶M-MLV及其配用體系購于TaKaRa公司；高保真聚合酶KOD及其配用體系購于日本TOYOBO公司；Easy Taq酶及其配用體系購于全式金公司；引物合成及后續(xù)測序工作由成都擎科生物技術有限公司完成；DMEM低糖培養(yǎng)基購于GIBCO公司；轉染試劑JetPEI購于Polyplus-transfection公司；5×細胞裂解液(5×Passive Lysis Buffer)和熒光素酶報告系統(tǒng)購于Promega公司。家雞Apelin多肽(TPLRQNPARAGRSQRPAGWRRRRPRPRLSHKGPMPF)和Apela多肽(LVRPRGARRGNVRRPGGWRRLRRP-RPRLSHKGPMPF)由上海吉爾生化公司合成。

1.2 方法

1.2.1家雞組織總RNA的提取分別取家雞不同組織樣品(盲腸、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、卵巢、精巢、大腦、小腦)于液氮中充分研磨至粉末，將60 mg磨碎組織加入到600 μL RNAzol中渦旋混勻；加入240 μL焦碳酸二乙酯(DEPC)滅菌水后渦旋混勻，于4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min；取上清，加入3 μL阿司咪唑(BAN)后渦旋混勻，于4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min；吸取上清液，加入等體積的異丙醇，渦旋混勻后于-20 ℃靜置20 min，于4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min；吸棄上清，用70%乙醇漂洗沉淀，于4 ℃、12 000 r·min-1離心3 min，重復該操作一次，吸棄上清；用20 μL DEPC-H2O溶解RNA沉淀，并儲存于-80 ℃冰箱中。

1.2.2cDNA模板制備以家雞組織總RNA為模板，按照逆轉錄試劑盒說明書操作。配制混合液1：RNA 2 μg和Olig-dT 1 μL，加入DEPC-H2O補足5 μL，于PCR儀中70 ℃反應10 min，取出靜置于冰上10 min。配制混合液2：5×Buffer 2 μL、dNTP 1 μL和M-MLV反轉錄酶0.5 μL，加入DEPC-H2O補足5 μL；將混合液1與混合液2混勻，然后放入PCR儀中，42 ℃反應1.5 h，70 ℃反應10 min，取終產(chǎn)物加入70 μL滅菌水后存于-20 ℃中，即為cDNA模板。

1.2.3家雞GPR15的引物設計及擴增根據(jù)Ensembl數(shù)據(jù)庫(http：//www.ensembl.org)中檢索得到的家雞GPR15的預測序列(登錄號：XM_004938212)，設計了用于克隆其cDNA序列的引物GPR15 F1/GPR15 R1，并且設計用于檢測GPR15在組織表達圖譜的實時定量PCR引物(表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

PCR反應以家雞盲腸來源的cDNA為模板。PCR反應體系按照KOD酶說明書配制，體系如下：5 μL 2×KOD緩沖液，2 μL盲腸cDNA模板，2 μL dNTPs，上、下游引物各0.1 μL，0.5 μL KOD-Fx聚合酶，0.3 μL去離子滅菌水。PCR反應程序為：94 ℃2 min；98 ℃10 s，60 ℃30 s，68 ℃90 s，35個循環(huán)；72 ℃20 min，12 ℃保存。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，純化后的PCR產(chǎn)物連接至pcDNA3.1(+)載體，通過序列測定，確定GPR15的cDNA序列。

1.2.4細胞轉染及熒光素酶活性測定待培養(yǎng)細胞密度至60%左右進行質(zhì)粒轉染。轉染體系為：受體基因表達載體或pcDNA3.1(+)空載體200 ng/孔；熒光素酶報告質(zhì)粒800 ng/孔；轉染試劑JetPEI 2 μL/孔；用轉染緩沖液配成總體系為100 μL的混合液，室溫放置10 min后，將轉染混合液加入到 6孔板中，4 h后更換培養(yǎng)基。配體(多肽或藥物)處理前，用胰蛋白酶液消化細胞，再將HEK293細胞傳代至96 孔板中，置于5%濃度CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后進行配體處理。配體處理時，按照10-12～10-5mol·L-1配制，處理6 h后，使用1×Passive Lysis Buffer充分裂解細胞，加入Luciferase底物后，在酶標儀中測定熒光素酶活性。具體方法參見Mo等(2017)和Zhang等(2018)，實驗數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 7進行分析處理。

1.2.5GPR15表達圖譜分析通過實時定量PCR(qPCR)技術，以家雞不同組織(盲腸、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、卵巢、精巢、大腦、小腦)的cDNA為模板，檢測GPR15基因的表達水平。PCR反應程序為：94 ℃2 min；98 ℃10 s，60 ℃20 s，68 ℃15 s，40個循環(huán)；72 ℃20 min，PCR產(chǎn)物由成都擎科梓熙生物技術有限公司進行測序，具體方法參見祝國強等(2017)和鄧秋洋等(2018)。同時利用轉錄組數(shù)據(jù)分析GPR15基因的組織表達。RNA-seq數(shù)據(jù)下載于NCBI數(shù)據(jù)庫(登錄號：PRJEB4677)，該實驗在1只雄性和1只雌性成年紅原雞Gallusgallus中共取得27個組織，包括脂肪、腎上腺、胸肌、小腦、大腦、心臟、下丘腦、腎臟、肝臟、肺、卵巢、腺胃、坐骨神經(jīng)、脾臟和精巢等，之后利用Salmon(v0.82)對RNA-seq數(shù)據(jù)進行轉錄本的定量(Patroetal.，2017)分析，TPM(transcripts per million)值表示轉錄本豐度，使用GraphPad Prism 7繪制圖片。

1.2.6生物信息學分析采用SeqMan和EditSeq進行測序結果序列拼接，用DNAMAN進行DNA和蛋白質(zhì)序列比對，使用CFX Manager進行qPCR數(shù)據(jù)定量分析；通過SWISS-MODEL(https：//www.swissmodel.expasy.org/)網(wǎng)站進行蛋白三維結構同源建模，使用MEGA 7進行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法(neighbor-joining method)，重復計算引導值(bootstrap values)達1 000次。

2 結果與分析

2.1 家雞GPR15基因的克隆及序列分析

根據(jù)家雞GPR15的預測序列(登錄號：XM_004938212)，設計引物GPR15 F1/R1。以家雞盲腸cDNA為模板進行PCR擴增，測序獲得家雞GPR15基因的cDNA序列(登錄號：MH293603)。序列分析表明：家雞GPR15基因編碼區(qū)cDNA序列長度為1 107 bp，含1個外顯子，編碼含368個氨基酸的受體蛋白(圖1：A)。家雞GPR15是具有7次跨膜結構的G蛋白偶聯(lián)受體(圖1：B、C)。家雞GPR15具有保守的GPCR結構特征：包括維持GPR15三維結構的二硫鍵(Cys113～Cys190)、參與受體激活和G蛋白偶聯(lián)信號轉導的保守“DRY”基序(位于第二胞內(nèi)域)以及“NP(XX)Y”基序(位于第七跨膜區(qū))。通過同源建模方法，本研究模擬了家雞GPR15的三維結構，可觀察到經(jīng)典的7次跨膜結構域，并預測其在C端具有1個α-螺旋結構(圖1：C)。

2.2 多物種GPR15的氨基酸序列比對

多物種氨基酸序列比對表明(圖2)：家雞GPR15分別與人、北美綠蜥蜴Anoliscarolinensis、小鼠GPR15具有中度的氨基酸序列一致性，分別為56.2%、55.9%、55.7%；與斑點雀鱔LepisosteusoculatusGPR15的氨基酸序列相似度相對較低，為35.2%。

圖2 家雞Gallus gallus domesticus GPR15與人Homo sapiens、北美綠蜥蜴Anolis carolinensis、小鼠Mus musculus、斑點雀鱔Lepisosteus oculatus GPR15的氨基酸比對Fig. 2 Amino acid sequence alignment of Gallus gallus domesticus GPR15 with that of Homo sapiens， Anolis carolinensis，Mus musculus， and Lepisosteus oculatus

2.3 GPR15系統(tǒng)進化分析及功能探究

GPR15基因位于家雞1號染色體上。選取斑胸草雀Taeniopygiaguttata、中華草龜Chinemysreevesii、北美綠蜥蜴、人和家雞的GPR15基因進行共線性分析。結果表明，家雞GPR15基因與斑胸草雀、中華草龜、北美綠蜥蜴、人的GPR15基因為直系同源基因(圖3)。

由于有研究報道GPR15與GPR25、APLNR受體有序列相似性，因此，本研究對GPR15、GPR25、APLNR、AGTR1、AGTR2等基因進行系統(tǒng)進化分析。聚類分析表明(圖4)，多個脊椎動物的GPR15、GPR25和APLNR基因可形成一個大的分支，并且GPR15還與GPR25形成一個小分支。這些結果提示GPR15與GPR25有較近的進化關系。在近期研究中，發(fā)現(xiàn)孤兒受體GPR25可被APLNR的配體Apelin和Apela多肽激活(Zhangetal.，2018)。據(jù)此，假設“Apelin和Apela或是GPR15的潛在配體”。

圖3 家雞Gallus gallus domesticus、斑胸草雀Taeniopygiaguttata、中華草龜Chinemys reevesii、北美綠蜥蜴Anoliscarolinensis和人Homo sapiens GPR15基因的共線性分析Fig. 3 Synteny analysis of GPR15 gene among Gallus gallus domesticus， Taeniopygia guttata， Chinemys reevesii，Anolis carolinensis and Homo sapiens

為驗證上述假設，本研究采用了pGL3-CRE-luciferase報告系統(tǒng)(Moetal.，2017；Zhangetal.，2018)，探究Apelin和Apela多肽(10-12～10-5mol·L-1，6 h)對表達于HEK293細胞中的家雞GPR15(cGPR15)的激活效應。家雞Apelin和Apela多肽不能激活家雞GPR15受體，從而無法影響forskolin(5 μmol·L-1)刺激的HEK293細胞的熒光素酶活性(圖5：A)。相反，在相同實驗條件下，家雞Apelin和Apela多肽可以劑量依賴地激活斑馬魚GPR25(zfGPR25)，抑制forskolin刺激的熒光素酶活性(圖5：B)(Zhangetal.，2018)。采用pGL4-SRE-luciferase報告系統(tǒng)(Moetal.，2017)也發(fā)現(xiàn)家雞Apelin和Apela多肽不能激活家雞GPR15(圖5：C)。上述結果暗示，與GPR25和APLNR不同(Chngetal.，2013； Paulietal.，2014； Zhangetal.，2018)，GPR15不能被Apelin和Apela肽激活。

圖4 脊椎動物中G蛋白偶聯(lián)受體A家族的系統(tǒng)進化分析Fig. 4 Phylogenetic analysis of class A GPCR family among vertebrates

圖5 家雞Gallus gallus domesticus GPR15的功能分析Fig. 5 Functional analysis of Gallus gallus domesticus GPR15 in cultured HEK293 cells by cell-based luciferase reporter system

2.4 GPR15的組織表達圖譜

采用qPCR檢測GPR15基因在家雞盲腸、心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、卵巢、精巢、大腦和小腦中的表達分布情況(圖6：A)，以肺中的表達水平為參照，GPR15基因相對高表達于脾臟中，而在盲腸和肺中有中等水平表達，在心臟、肝臟、腎臟、卵巢、精巢、小腦和大腦中，僅檢測到微弱表達。與qPCR結果高度類似，轉錄組數(shù)據(jù)分析(圖6：B)也揭示GPR15基因高表達于家雞祖先紅原雞脾臟中，在肺中中等表達，而在卵巢、精巢、坐骨神經(jīng)等組織中微弱表達。

圖6 雞GPR15基因的組織表達圖譜分析Fig. 6 Tissue expression of chicken GPR15 gene

3 討論

GPR15作為G蛋白偶聯(lián)受體家族成員備受關注。已有研究表明在小鼠中，GPR15可介導腸道穩(wěn)態(tài)并參與調(diào)控腸道炎癥反應(Kimetal.，2013)。鑒于GPR15的重要生理功能，本研究首次從家雞中成功克隆到GPR15基因，并嘗試尋找其內(nèi)源性配體，揭示其組織表達特征，為闡釋GPR15在禽類免疫和腸道穩(wěn)態(tài)中的生理作用奠定基礎。

本研究首先克隆了家雞GPR15基因，發(fā)現(xiàn)其編碼區(qū)序列全長為1 107 bp，含1個外顯子，編碼含368個氨基酸的受體蛋白。家雞GPR15也具7次跨膜結構域，其氨基酸序列與人、北美綠蜥蜴、小鼠具有約56%氨基酸序列一致性；共線性分析表明家雞GPR15基因是人GPR15基因的直系同源基因。系統(tǒng)進化分析顯示GPR15與GPR25和APLNR有較近的進化關系。盡管有研究發(fā)現(xiàn)小鼠和人GPR15L基因可以編碼GPR15的配體(Suplyetal.，2017)，但是GPR15L基因在非哺乳類脊椎動物中似乎已消失，因此，在包括家雞在內(nèi)的非哺乳動物中，GPR15的配體仍待鑒定。同時，本研究小組最新研究結果表明，APLNR內(nèi)源性配體Apelin和Apela肽可以激活GPR25(Zhangetal.，2018)。鑒于GPR15與GPR25具有較近的進化關系，亦初步探究了Apelin和Apela對家雞GPR15的激活效應。結果表明Apelin和Apela不能激活表達于HEK293細胞中的家雞GPR15，而在相同實驗條件下，Apelin和Apela可以激活斑馬魚GPR25。因此，在非哺乳類脊椎動物中，GPR15的功能和內(nèi)源性配體仍待鑒定。

qPCR分析發(fā)現(xiàn)，家雞GPR15基因在脾臟中表達豐度最高，其次是盲腸、肺等。這與哺乳動物中的發(fā)現(xiàn)基本一致，如GPR15在人淋巴細胞中具有最高的表達水平，其次高表達于結腸和小腸等組織(Koks & Koks， 2017)，在脾臟亦能檢測到較高的表達水平(Dengetal.，1997)。Western blot檢測到GPR15蛋白可在人睪丸和肝臟中表達，而在大腦、胎盤、肺、子宮、心臟、胰腺或骨骼肌中無表達(Claytonetal.，2001)。在小鼠中，脾臟GPR15可與血栓調(diào)節(jié)素相互作用緩解敗血癥(Panetal.，2017)。GPR15在家雞脾臟中的高表達，提示其可能參與脾臟中的免疫反應。家雞GPR15在盲腸組織中的表達結果與哺乳動物中的發(fā)現(xiàn)也一致(Dengetal.，1997)。在小鼠中，廣譜抗生素治療可降低腸道GPR15的表達量，推測GPR15可能在平衡腸道微生物菌群中發(fā)揮作用(Kimetal.，2013)，至于GPR15是否在家雞盲腸中發(fā)揮類似效應，值得關注和深入研究。