侯禎丹，屈 燕，黃 鴻，熊 健，冷秋思

(西南林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院/園林植物與觀賞園藝省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

【研究意義】貝利葉綠絨蒿(Meconopsisbaileyi)、多刺綠絨蒿(Meconopsishorridula)和高莖綠絨蒿(Meconopsissuperba)屬罌粟科(Papaveraceae)綠絨蒿屬(Meconopsis)，根據(jù)Gray Wilson (2012)最新的分類(lèi)系統(tǒng)，分別來(lái)自Meconopsis，Grandes，Cumminsia3個(gè)屬，主要生長(zhǎng)在高海拔地區(qū)的流石灘，高海拔地區(qū)空氣稀薄、氣溫低、溫差較大、日照輻射強(qiáng)烈，且大風(fēng)襲擊使地表覆蓋大量的礫石層，表面土壤稀少，其幼苗在發(fā)育早期，必須忍受高山環(huán)境寒冷多變的氣候特征。因此，貝利葉綠絨蒿、多刺綠絨蒿和高莖綠絨蒿是研究高山植物在低溫脅迫下生理生化變化的理想材料。 【前人研究進(jìn)展】綠絨蒿屬植物是云南著名的高山野生花卉，其花大、顏色豐富，具有巨大的遺傳育種潛力，同時(shí)還有清熱解毒、利尿、消炎、止痛等醫(yī)藥功效[1]。低溫及低溫脅迫時(shí)間的長(zhǎng)短都會(huì)對(duì)植物體造成生理?yè)p傷，導(dǎo)致葉片表面呈水漬狀，使葉片容易受病菌的感染或造成植物體局部壞死，影響植物的正常生長(zhǎng)[2]。任祝三[3]對(duì)總狀綠絨蒿、全緣葉綠絨蒿和粗壯綠絨蒿幼苗的生長(zhǎng)氣候進(jìn)行研究，結(jié)果表明幼苗生長(zhǎng)受氣候條件影響較顯著。【本研究切入點(diǎn)】通過(guò)人工模擬低溫脅迫(4 ℃)不同時(shí)間下，對(duì)3種綠絨蒿幼苗葉片細(xì)胞的葉綠素含量、MDA含量、可溶性蛋白含量、游離脯氨酸含量及保護(hù)酶活性的變化進(jìn)行分析，研究3種綠絨蒿在低溫處理不同時(shí)間的生理生化指標(biāo)的變化規(guī)律。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究低溫脅迫時(shí)間對(duì)不同綠絨蒿亞屬幼苗生理生化特性的影響，為綠絨蒿屬植物的引種栽培以及高山花卉植物抗低溫鑒定提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以多刺綠絨蒿、貝利葉綠絨蒿、高莖綠絨蒿的半年生實(shí)生苗為材料，塑料花盆直徑9 cm、高9 cm，基質(zhì)為蛭石+珍珠巖+泥炭土(1∶1∶7)的混合基質(zhì)。置于溫度為20 ℃、濕度為75 %、光照設(shè)置為白天12 h、光照強(qiáng)度為120 μmol/m2·s夜間12 h、相對(duì)濕度保持在75 %～85 %的德國(guó)智能人工氣候培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)6 d，在此期間根據(jù)生長(zhǎng)情況加入適量的水分。

1.2 試驗(yàn)方法

選取生長(zhǎng)健康和長(zhǎng)勢(shì)基本一致的幼苗6株，放置在德國(guó)智能型人工氣候箱內(nèi)(Binder710,德國(guó))進(jìn)行低溫處理。光照強(qiáng)度為120 μmol/m2·s，光照時(shí)間8:00-20:00時(shí)，相對(duì)濕度保持在75 %～80 %，以20 ℃進(jìn)行第0小時(shí)(對(duì)照)測(cè)定，設(shè)置人工氣候箱以4 ℃/h降溫，降至(4.0±0.5)℃保持該溫度為低溫處理溫度，在第24、48、72小時(shí)以及恢復(fù)20 ℃ 48 h (低溫解除，記為re48 h)進(jìn)行各項(xiàng)生理指標(biāo)測(cè)定。

1.3 葉片采集

葉片樣品采集時(shí)間為8:30 am，以綠絨蒿幼苗葉片的全展葉為材料，將蒸餾水洗凈的葉片磨碎進(jìn)行不同生理指標(biāo)測(cè)定，每個(gè)指標(biāo)做6個(gè)重復(fù)。

1.4 生理指標(biāo)的測(cè)定

葉綠素含量的測(cè)定用分光光度法；丙二醛(MDA)測(cè)定采用硫代巴比妥酸法；超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原法；游離脯氨酸的測(cè)定采用磺基水楊酸法；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠素含量變化

由圖1可知，3種綠絨蒿幼苗葉片的葉綠素含量均呈現(xiàn)先降后升的趨勢(shì)。貝利葉綠絨蒿和高莖綠絨蒿在24 h下降幅度最大，分別為43.64 %和29.57 %，貝利葉綠絨和高莖綠絨蒿在低溫處理24 h后，隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)葉片的葉綠素含量逐漸呈上升趨勢(shì)；多刺綠絨蒿葉綠素含量則在48 h最低，下降幅度為23.07 %?；謴?fù)48 h后，貝利葉綠絨蒿和多刺綠絨蒿的葉綠素含量下降幅度為處理前的15.39 %和12.04 %，高莖綠絨蒿葉綠素含量上升幅度為處理前的6.71 %。

圖1 低溫脅迫下3種綠絨蒿幼苗葉綠素含量變化Fig.1 Changes of chlorophyll contents of three Meconopsis seedlings under low temperature stress

2.2 MDA含量變化

由圖2可知，3種綠絨蒿幼苗葉片MDA含量均呈先升后降趨勢(shì)。低溫處理24 h貝利葉綠絨蒿和高莖綠絨蒿上升較快，上升幅度分別為處理前的145.2 %和154.6 %，在低溫脅迫時(shí)間24 h后，這2種綠絨蒿的MDA含量均呈下降趨勢(shì)，恢復(fù)48 h后MDA的含量比處理之前高，上升幅度分別5.82 %和13.5 %；多刺綠絨蒿幼苗葉片在低溫脅迫時(shí)間為72 h時(shí)MDA含量最高，上升幅度為處理之前的67.85 %。

2.3 可溶性蛋白含量變化

由圖3可知，3種綠絨蒿的蛋白含量均呈先升后降趨勢(shì)，貝利葉綠絨蒿和多刺綠絨蒿的葉片蛋白含量在低溫處理24 h含量最高，上升幅度分別為53.82 %和103.27 %，在恢復(fù)48 h后貝利葉綠絨蒿和高莖綠絨蒿葉片可溶性蛋白含量上升幅度為處理前的11.92 % 和47.57 %；高莖綠絨蒿幼苗葉片可溶性蛋白含量處理72 h時(shí)最高，上升幅度為處理前的108.24 %，在恢復(fù)48 h后可溶性蛋白含量為處理前的47.57 %。

圖2 低溫脅迫下3種綠絨蒿幼苗MDA含量變化Fig.2 Changes of MDA contents of three Meconopsis seedlings under low temperature stress

圖3 低溫脅迫下3種綠絨蒿幼苗可溶性蛋白含量變化Fig.3 Changes of soluble protein contents of three Meconopsis seedlings under low temperature stress

圖4 低溫脅迫下3種綠絨蒿幼苗SOD活性變化Fig.4 Changes of SOD activity of three Meconopsis seedlings under low temperature stress

2.4 SOD活性變化

由圖4可知，3種綠絨蒿幼苗葉片SOD活性均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)。高莖綠絨蒿幼苗葉片的SOD活性比較高，貝利葉綠絨蒿和多刺綠絨蒿的SOD活性較低；在低溫處理24 h時(shí)，貝利葉綠絨蒿和多刺綠絨蒿SOD活性最強(qiáng)，上升幅度分別為處理前的 159.16 % 和9.18 %，在低溫處理48 h后貝利葉綠絨蒿SOD活性迅速下降，貝利葉綠絨蒿和多刺綠絨蒿恢復(fù)48 h后SOD的活性均比處理前低，下降幅度為13.82 %和59.88 %；而在低溫處理48 h時(shí)，高莖綠絨蒿幼苗葉片SOD活性最強(qiáng)，上升幅度為處理前的79.78 %，之后隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，在低溫脅迫恢復(fù)48 h時(shí)，下降幅度為低溫處理前的6.15 %。

2.5 游離脯氨酸含量變化

由圖5可知，3種綠絨蒿幼苗葉片游離脯氨酸含量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在低溫脅迫24 h貝利葉綠絨蒿和高莖綠絨蒿幼苗葉片游離脯氨酸含量上升幅度較快，上升幅度是處理前的118.75 %和445.13 %，到48 h后游離脯氨酸的含量呈下降趨勢(shì)，恢復(fù)48 h后游離脯氨酸的含量比低溫處理前低，下降幅度分別為4.17 %和41.59 %；而多刺綠絨蒿幼苗在低溫處理48 h前呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，低溫處理48 h時(shí)上升幅度為140 %，之后葉片中游離脯氨酸含量開(kāi)始下降，恢復(fù)48 h后游離脯氨酸含量上升幅度為處理前27.5 %。

圖5 低溫脅迫下3種綠絨蒿幼苗游離脯氨酸含量變化Fig.5 Changes of free proline contents of three Meconopsis seedlings under low temperature stress

3 討 論

3.1 低溫脅迫時(shí)間與葉片葉綠素含量

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所，逆境脅迫下部分光合機(jī)制遭到破壞，植物體內(nèi)的葉綠素含量為適應(yīng)逆境環(huán)境而產(chǎn)生生理變化[4]。光合作用是植物能量轉(zhuǎn)化的來(lái)源，植物對(duì)低溫最敏感的器官是光合器官，低溫又影響葉綠素的合成，更造成葉綠素降解加強(qiáng)，導(dǎo)致植物幼苗的光合減弱。張雪[5]研究發(fā)現(xiàn)，低溫下葉片內(nèi)葉綠素含量略有增加，可能是由于葉綠素形成的最低溫度是2～4 ℃；張學(xué)財(cái)[6]等的研究發(fā)現(xiàn)在4 ℃處理時(shí)，3種劍麻品種葉綠素含量先降后升，這也可能是機(jī)體對(duì)低溫環(huán)境逐步適應(yīng)的表現(xiàn)。本研究中3種綠絨蒿幼苗葉片在低溫脅迫下葉綠素含量均呈先降后升的趨勢(shì)，貝利葉綠絨蒿和高莖綠絨蒿幼苗葉片處理24 h葉綠素含量先大幅度下降再逐漸上升，多刺綠絨蒿處理48 h緩慢降到最低隨后上升，說(shuō)明在低溫處理初期綠絨蒿幼苗葉片無(wú)法進(jìn)行光合作用，導(dǎo)致幼苗無(wú)法合成葉綠素并開(kāi)始降解，故葉綠素含量降低；隨后葉綠素含量逐漸上升，說(shuō)明在持續(xù)4 ℃的低溫下，低溫沒(méi)有使葉綠素合成受到破壞，而是限制了葉綠素的合成。貝利葉綠絨蒿和高莖綠絨蒿幼苗葉片葉綠素含量處理24 h時(shí)最低，隨后葉綠素含量遞增，而多刺綠絨蒿處理48 h時(shí)葉綠素含量最低，而后逐漸升高，說(shuō)明貝利葉綠絨蒿和高莖綠絨蒿在低溫處理下能更快速地對(duì)低溫逆境脅迫做出反應(yīng)。

3.2 低溫脅迫時(shí)間與MDA含量

植物器官在低溫逆境條件下，會(huì)發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用產(chǎn)生MDA。植物細(xì)胞質(zhì)膜損傷的程度由MDA含量的變化反應(yīng)，MDA在一定程度上也反映了植物抗逆性的強(qiáng)弱，葉片中MDA積累越少，膜質(zhì)過(guò)氧化程度小，表明組織的抗逆性越強(qiáng)。田丹青[7]的研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理12 h 后3個(gè)紅掌品種葉片的 MDA 含量均呈降低的趨勢(shì)，MDA含量隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，這與相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定結(jié)果以及冷害癥狀表現(xiàn)一致。張玲麗[8]的研究發(fā)現(xiàn)14個(gè)百合品種在低溫脅迫1～3 d后所有百合品種MDA含量都有不同程度的升高，低溫脅迫3 d后，各品種的MDA含量呈極顯著差異。本研究低溫脅迫3種綠絨蒿的葉片MDA含量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，貝利葉綠絨蒿和高莖綠絨蒿幼苗在低溫脅迫24 h MDA含量呈先大幅上升再緩慢下降的變化趨勢(shì)，表明細(xì)胞膜系統(tǒng)受到損傷，保護(hù)酶清除速率低于活性氧產(chǎn)生速率，積累大量活性氧，導(dǎo)致膜質(zhì)過(guò)氧化作用更加劇烈，MDA含量快速增加，嚴(yán)重阻礙了保護(hù)酶活性并降低抗氧化物的含量[9]，迫使細(xì)胞膜系統(tǒng)損傷更加嚴(yán)重[10]；多刺綠絨蒿幼苗葉片MDA含量隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)且增幅小，說(shuō)明其在低溫逆境條件下，膜質(zhì)過(guò)氧化程度小，表明多刺綠絨蒿幼苗葉片組織的抗逆性強(qiáng)。貝利葉綠絨蒿和高莖綠絨蒿幼苗葉片處理24 h時(shí)MDA含量最高，隨后呈遞減趨勢(shì)，多刺綠絨蒿處理72 h 時(shí)MDA含量最高，且多刺綠絨蒿MDA含量增幅小。

3.3 低溫脅迫時(shí)間與可溶性蛋白含量

在逆境環(huán)境下植物通過(guò)可溶性物質(zhì)的積累來(lái)調(diào)節(jié)滲透，可溶性蛋白含量的變化反應(yīng)了植物合成和代謝能力，低溫條件下，可溶性蛋白含量的增加，有助于加強(qiáng)細(xì)胞的保水能力，從而提高植物體的抗寒性?？购詮?qiáng)的品種可溶性蛋白含量高，在低溫逆境環(huán)境中可溶性蛋白含量呈上升趨勢(shì)[11]。沙偉[12]等的研究發(fā)現(xiàn)在低溫脅迫下扎龍?zhí)J葦葉片內(nèi)可溶性蛋白的含量明顯下降，但仍高于對(duì)照組。在低溫脅迫下抗寒性強(qiáng)的葡萄品種可溶性蛋白含量高且增加幅度大[13]；在低溫脅迫下隨溫度的降低蕓香可溶性蛋白含量增加[14]；抗寒性強(qiáng)的葡萄品種可溶性蛋白形成早且含量高[15]。楊慧菊[16]等研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫下馬鈴薯幼苗的可溶性蛋白含量不斷上升。本研究貝利葉綠絨蒿和高莖綠絨蒿幼苗葉片在恢復(fù)48 h后可溶性蛋白含量下降，但仍高于處理前含量，細(xì)胞的持水力由可溶性蛋白的親水膠體性決定，可溶性蛋白含量的增加可以約束更多的水分，減少原生質(zhì)因結(jié)冰而傷害致死的機(jī)率。貝利葉綠絨蒿和多刺綠絨蒿幼苗處理24 h可溶性蛋白含量最低，隨低溫脅迫處理時(shí)間延長(zhǎng)可溶性蛋白呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明抗寒能力弱，而高莖綠絨蒿幼苗葉片內(nèi)可溶性蛋白含量隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)明顯上升，處理72 h可溶性蛋白含量最高，說(shuō)明低溫處理后高莖綠絨蒿幼苗葉片內(nèi)可溶性蛋白可能是從膜上或其它的結(jié)合形式中降解釋放的，也可能是有新的蛋白質(zhì)合成。

3.4 低溫脅迫時(shí)間與SOD活性

在植物體內(nèi)多種酶維持活性氧在動(dòng)態(tài)平衡的低水平，是植物對(duì)低溫逆境脅迫的初始反應(yīng)。超氧化物陰離子自由基產(chǎn)生的H2O2和O2可以被SOD清除，從而防止活性氧過(guò)多積累對(duì)植物體造成傷害來(lái)維持活性氧的動(dòng)態(tài)平衡。張尚雄等[17]研究表明3個(gè)披堿草屬牧草隨低溫脅迫的增強(qiáng)葉片SOD活性急劇增加，表明3個(gè)披堿草屬牧草受到寒冷脅迫時(shí)產(chǎn)生了氧自由基以抵御寒冷。本研究低溫脅迫下3種綠絨蒿SOD活性均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，持續(xù)低溫脅迫誘導(dǎo)激發(fā)了酶的活性使酶活性增強(qiáng)，從而提高植物體細(xì)胞抗寒性，由于環(huán)境溫度過(guò)低導(dǎo)致酶的活性下降，從而使植物體細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞，活性氧被保護(hù)酶系統(tǒng)清除的能力下降，活性氧大量積累致使膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能受到破壞。貝利葉綠絨蒿和多刺綠絨蒿幼苗葉片SOD活性處理24 h活性最強(qiáng)，而高莖綠絨蒿處理72 h活性最強(qiáng)，增幅最大。

3.5 低溫脅迫時(shí)間與游離脯氨酸含量

游離脯氨酸是滲透脅迫下產(chǎn)生的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，能保護(hù)植物體細(xì)胞內(nèi)生物大分子、穩(wěn)定細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及保持氮含量的作用[18]。王靜[19]等研究認(rèn)為，脯氨酸含量與植物抗寒性關(guān)系密切，低溫脅迫程度增加會(huì)使游離脯氨酸含量增加。鄧雪珂等[20]研究表明，紫花苜蓿隨低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)游離脯氨酸含量大幅增加，在低溫脅迫12 h后游離脯氨酸含量增加十分顯著。羅新義等[21]發(fā)現(xiàn)，隨低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)肇東苜蓿葉片中游離脯氨酸含量逐漸增加。本研究低溫脅迫下3種綠絨蒿幼苗葉片游離脯氨酸含量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，貝利葉綠絨蒿和高莖綠絨蒿在處理24 h時(shí)游離脯氨酸的積累達(dá)到峰值隨后下降，有可能是超過(guò)滲透調(diào)節(jié)能力范圍造成的生理?yè)p傷反應(yīng)；多刺綠絨蒿隨低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，在處理48 h時(shí)達(dá)到峰值，游離脯氨酸的積累可能對(duì)植物體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)起到了作用。高莖綠絨蒿在處理24 h時(shí)游離脯氨酸含量較其它兩種綠絨蒿增幅大。

4 結(jié) 論

通過(guò)比較3種綠絨蒿在低溫脅迫下，其生理生化指標(biāo)對(duì)低溫的響應(yīng)規(guī)律，發(fā)現(xiàn)3種綠絨蒿均具有一定的抗寒性，而高莖綠絨蒿較之其它兩種的抗寒能力更強(qiáng)。研究結(jié)果可為今后綠絨蒿屬植物雜交育種、抗寒基因篩選等工作提供參考。