熊陽(yáng)陽(yáng)，和文志，于文劍，高鵬華，王 錦*

(1.西南林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650224)

被譽(yù)為“攀援植物皇后”的鐵線蓮隸屬毛茛科(Ranunculaceae)鐵線蓮屬(Clematis)，多為落葉木質(zhì)藤本?；▋尚曰騿涡?，組成聚傘花序或單生；萼片花瓣?duì)?，著色豐富；無(wú)花瓣；雄蕊多數(shù)，心皮多數(shù)。大花鐵線蓮品種因其花型大而多樣、萼瓣顏色豐富等特點(diǎn)應(yīng)用極為廣泛，其通常為單被花，萼瓣5～8枚；也有一些為重被或半重被品種，只有極少數(shù)完全重被。大花鐵線蓮品種分為早花組和晚花組，早花品種花期2次，萼瓣上有清晰脈紋，第1個(gè)主花期的花朵開放于頭年老枝，花芽在秋季霜凍前就已經(jīng)完成，春季到來(lái)腋芽處會(huì)長(zhǎng)出新的枝條。晚花品種花開放在當(dāng)年新枝上，花量充沛，但萼瓣上無(wú)清晰脈紋[1]?！狙芯恳饬x】大花鐵線蓮重被品種具有重要的觀賞園藝地位和研究?jī)r(jià)值。重瓣型栽培品種的研究工作對(duì)今后植物品種的應(yīng)用推廣具有現(xiàn)實(shí)意義，而重被大花鐵線蓮品種花形多樣，部分品種在不同季節(jié)表現(xiàn)為重被與單被的特性為探究重被花的形成機(jī)制提供了很好的研究素材?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前關(guān)于大花鐵線蓮重被品種的研究?jī)H有栽培技術(shù)[2-3]及組織培養(yǎng)[4-6]等方面的報(bào)道，大花鐵線蓮花器官發(fā)育的研究也限于單被品種[7-8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】以3種花被類型(單被、重被、完全重被)的大花鐵線蓮品種為試材，采用常規(guī)石蠟切片法和顯微技術(shù)對(duì)其花芽分化過(guò)程進(jìn)行觀察分析?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】初步闡明大花鐵線蓮重被花的起源方式，為研究鐵線蓮重被花形成機(jī)制奠定形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為西南林業(yè)大學(xué)鐵線蓮種質(zhì)資源圃內(nèi)3種花被類型(單被、重被、完全重被)的大花鐵線蓮品種“朱卡”(C.‘Julka’)，“薇安”(C.‘Vyvyan Pennell’)、“藍(lán)光”(C.‘Blue Light’)。試驗(yàn)觀測(cè)時(shí)間2017年3-10月，每隔6 d取材1次，隨機(jī)采取頂芽或上節(jié)位葉腋處的花芽數(shù)個(gè)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品固定與保存 將所采花芽放入50 % FAA中固定，抽氣2 h后置于室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 脫水 采用酒精梯度濃度法脫水。具體程序?yàn)椋?0 %乙醇→85 %乙醇→95 %乙醇→叔丁醇→叔丁醇，各梯度脫水時(shí)間間隔30 min。

1.2.3 浸蠟與包埋 材料脫水完成后重新加入叔丁醇與碎蠟(1∶1)放入60 ℃恒溫箱過(guò)夜。第2天傾去原蠟液后倒入純蠟液，共換2次，每次間隔1 h。待牛皮紙盒底部蠟略凝時(shí)將材料切面朝下填入。

1.2.4 切片與粘片 修整蠟塊，用KD-3358 切片機(jī)切片，厚度為8 μm。將粘有切好的蠟帶的載玻片放入40 ℃的展片臺(tái)上。玻片自然風(fēng)干5～7 d。

1.2.5 脫蠟與染色 將晾好的切片依次放入二甲苯→酒精→二甲苯中進(jìn)行脫蠟，每次5 min。番紅過(guò)夜，固綠30 s。

1.2.6 封片 切片取出后用中性樹膠封固，待3～5 d后顯微鏡觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 開花生物學(xué)特性觀察

從花的構(gòu)造來(lái)看，鐵線蓮與其他植物最主要的區(qū)別在于它的‘花’不是由花瓣組成，而是萼片瓣化構(gòu)成了花的形態(tài)。嚴(yán)格意義上講，鐵線蓮是沒(méi)有花瓣的，植物學(xué)家們將這種花瓣?duì)畹妮嗥Q為“萼瓣”[1]。由于萼瓣數(shù)的不同，鐵線蓮的花顯現(xiàn)出單瓣、半重瓣及重瓣3種不同的形態(tài)。本次研究選用鐵線蓮不同花瓣類型的代表品種作為供試材料，為研究鐵線蓮重被花的形態(tài)發(fā)育提供更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)睦碚撘罁?jù)。

薇安(C.‘Vyvyan Pennell’)為早花大花型品種。高2.5～3 m，花深藍(lán)紫色，花蕊白色，花藥米黃色多數(shù)，花徑18～22 cm。葉長(zhǎng)約8 cm，寬5 cm，花梗長(zhǎng)約6 cm?；ㄆ?次，晚春重瓣或半重瓣花開于老枝上，萼瓣數(shù)多可達(dá)70枚；早秋單被花開于當(dāng)年新枝，萼瓣數(shù)6～9枚。據(jù)花期觀測(cè)記錄初花日期在3月20日，終花期在9月25日前后。

藍(lán)光(C.‘Blue Light’)為早花大花型重被品種。高2～2.5 m，花中央雌雄蕊都完全瓣化，形成蓮座狀的完全重被花，花色淺藍(lán)，花蕊米黃色，萼瓣多數(shù)，花徑10～14 cm，葉長(zhǎng)約5 cm，寬3 cm，花梗長(zhǎng)約6 cm。花期2次，老枝新枝均開重被花。初花日期約在3月5日，終花期在9月20日前后。

朱卡(C.‘Julka’)為早花大花型單被品種，高2～2.5 m，花平盤單瓣形，紫羅蘭色，萼瓣6～8枚，中間有深紫紅色條帶，雄蕊亮白色和紫色多數(shù)?；◤?2～15 cm，葉長(zhǎng)約5 cm，寬2.5 cm，花梗長(zhǎng)約3 cm。初花日期約在3月25日，終花期在9月初，花期1次，長(zhǎng)達(dá)4個(gè)月。

2.2 花芽分化時(shí)期觀察

2.2.1 花芽分化前期 頂芽?jī)?nèi)分生組織的細(xì)胞活動(dòng)開始活躍，其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)錐呈尖圓狀。在莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的基部、生長(zhǎng)錐兩側(cè)產(chǎn)生的突起即葉原基。生長(zhǎng)錐隨著花芽的生長(zhǎng)表面積逐漸變大，葉原基接著向上伸長(zhǎng)進(jìn)行分化[7]。3個(gè)大花鐵線蓮品種的花芽分化前期生長(zhǎng)錐形態(tài)差異不大，‘薇安’的生長(zhǎng)錐頂端較圓，基部較大(圖2)。

A：薇安；B：藍(lán)光；C：朱卡A: Clematis.‘Vyvyan Pennell’; B: Clematis.‘Blue Light’; C: Clematis.‘Julka’圖1 3種鐵線蓮供試材料Fig.1 Test materials of three kinds of clematis

A：薇安花芽分化前期；B：藍(lán)光花芽分化前期；C：朱卡花芽分化前期；GC：生長(zhǎng)錐(頂端分生組織)；LP：葉原基A:Early flower bud differentiationof C.‘Vyvyan Pennell’; B:Early flower bud differentiation of C.‘Blue Light’; C:Early flower bud differentiation of C.‘Julka’; GC: Growth cone (apical meristem); LP: Leaf primordium圖2 不同大花鐵線蓮的花芽分化前期Fig.2 Early flower bud differentiation of different large flower clematises

2.2.2 花芽分化初期 在花芽分化初期，突起的生長(zhǎng)點(diǎn)先端變的寬而肥大，呈近半球狀向上隆起?；ㄔ窃谏L(zhǎng)點(diǎn)的頂端進(jìn)行分化，當(dāng)植物生長(zhǎng)發(fā)育到一定階段時(shí)由于分生組織活動(dòng)進(jìn)入生殖生長(zhǎng)，莖頂端分生組織橫徑加大，逐漸由尖變平[7]，進(jìn)而轉(zhuǎn)向花的分化形成花原基(圖3)。

2.2.3 萼片原基分化期 開始分化的頂端分生組織變寬，花原基的兩側(cè)有小突起產(chǎn)生，形成萼片原基。鐵線蓮“花瓣”由花瓣?duì)钶嗥只鴣?lái)，這個(gè)時(shí)期可稱之為花被原基的分化期(圖4)。

A：薇安花芽分化初期；B：藍(lán)光花芽分化初期；C：朱卡花芽分化初期；FP：花原基A: The beginning of the flower bud differentiation of C.‘Vyvyan Pennell’；B: The beginning of the flower bud differentiation of C.‘Blue Light’；C: The beginning of the flower bud differentiation of C.‘Julka’; FP: Flower primordium圖3 不同大花鐵線蓮的花芽分化初期Fig.3 The beginning of the flower bud differentiation of different large flower clematises

A：薇安萼片原基分化期；B：藍(lán)光萼片原基分化期；C：朱卡萼片原基分化期；CaP：萼片原基A: Sepal primordium differentiation stageof C.‘Vyvyan Pennell’; B: Sepal primordium differentiation stageof C.‘Blue Light’; C: Sepal primordium differentiation stageof C.‘Julka’; CaP: Sepal primordium圖4 不同大花鐵線蓮的萼片原基分化期Fig.4 Sepal primordium differentiation stage of different large flower clematises

2.2.4 雄蕊原基分化期 隨著萼片原基的伸長(zhǎng)，在萼片原基內(nèi)側(cè)基部顯示出新的背腹形態(tài)，雄蕊原基形成。萼片發(fā)育時(shí)緊緊包裹花原基所產(chǎn)生的擠壓使得剛發(fā)生的幾枚雄蕊原基呈三角狀，隨著雄蕊原基的向心發(fā)生和數(shù)目不斷增多，雄蕊原基的螺旋狀序列逐漸明顯，花原基形狀均呈半球狀突起[8](圖5)。

2.2.5 雌蕊原基分化期 萼片原基此時(shí)期已分化成為花瓣?duì)钶嗥?，部分雄蕊原基分化成雄蕊，在萼片和雄蕊原基的?nèi)側(cè)，花托頂端中央向上部分出現(xiàn)多個(gè)突起，即雌蕊原基。此時(shí)雄蕊由小而圓的花瓣?duì)钗镒兊脤挻蟊馄?，形成花瓣?duì)?。雌蕊原基?jīng)發(fā)育分化成雌蕊(圖6)。

2.2.6 重被與完全重被品種雄雌蕊瓣化形成期 相較于大花鐵線蓮單被品種朱卡，重被品種薇安與完全重被品種藍(lán)光在雄蕊原基和雌蕊原基已經(jīng)分化形成雄蕊和雌蕊后，會(huì)發(fā)生瓣化現(xiàn)象。重被品種薇安雄蕊瓣化，而雌蕊保持原有形態(tài)。完全重被品種藍(lán)光雌雄蕊均瓣化，且雄蕊先于雌蕊瓣化(圖7)。

A：薇安雄蕊瓣化形成；B：藍(lán)光雄雌蕊瓣化形成；0：胚珠；St：雄蕊； Pi：雌蕊A: Stamen petaloidof C.‘Vyvyan Pennell’; B: Stamen and pistil petaloid of C.‘Blue Light’; 0: Ovule; St: Stamen; Pi: Pistil圖7 重被及完全重被大花鐵線蓮的瓣化Fig.7 Petalody of double perianth and fully double large flower clematises

3 討 論

自然界有豐富多彩的重瓣觀賞植物，重瓣花起源方式大致分為6種，即積累起源、苞片起源、雌雄蕊起源、臺(tái)閣起源、重復(fù)起源和花序起源。雌雄蕊瓣化從形態(tài)上表現(xiàn)為雌雄蕊從外向內(nèi)減少或退化，花瓣數(shù)增加，花瓣由外向內(nèi)逐漸變小，直到出現(xiàn)花瓣和雄蕊的過(guò)渡形態(tài)，有些還有花絲或花藥的痕跡，或者僅花絲變成花瓣?duì)頪9]。早年Lehmann和Sattler對(duì)毛茛科紅類葉升麻(Actaearubra)花發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn)，萼片內(nèi)方二輪10個(gè)雄蕊原基在發(fā)育過(guò)程中可發(fā)育成花瓣，也可以形成雄蕊，即花瓣和雄蕊可以互相取代，證明了毛莨科的內(nèi)花瓣可能起源于雄蕊[10]。植物光合日變化與其生理生態(tài)因子受內(nèi)外環(huán)境的影響會(huì)有所不同[11]，植物花瓣的重瓣性表型是遺傳物質(zhì)和環(huán)境因子共同作用的結(jié)果[12]。以大花鐵線蓮重被品種薇安為典型代表的開花特性(晚春至早夏開重被花，在早秋二次開單被花)就是如此。

4 結(jié) 論

大花鐵線蓮重被花和完全重被花為典型的雌雄蕊起源方式。大花鐵線蓮的花芽分化順序都是由外向內(nèi)進(jìn)行，其過(guò)程可分為花芽分化前期、花芽分化初期、萼片原基分化期，雄蕊原基分化期和雌蕊原基分化期；完全重被品種藍(lán)光在雄蕊雌蕊成形后產(chǎn)生瓣化現(xiàn)象。通常雄蕊先于雌蕊發(fā)生瓣化，而重被品種薇安僅雄蕊瓣化。觀賞植物的花朵重瓣程度高低對(duì)其觀賞效果有極大的影響，大花鐵線蓮花形特征和變化方式是其重要的觀賞特性，也是研究花器官發(fā)育與形成機(jī)制的理想材料。本研究初步闡明大花鐵線蓮重被花的起源方式，關(guān)于影響大花鐵線蓮重被花形成的主要環(huán)境因素及適值、可能控制鐵線蓮重被花形成的相關(guān)基因的篩選及基因克隆與表達(dá)分析等問(wèn)題還有待進(jìn)一步探究。